Aplicación del alil isotiocianato como antifúngico natural para higos

Durante el periodo de conservación de las frutas, y en particular de higos frescos (Ficus carica L.), se producen pérdidas postcosecha debidas principalmente a alteraciones fúngicas que dan lugar a podredumbres y, por tanto, al rechazo del producto. Para evitar estas podredumbres, el sistema de control más extendido es el empleo de fungicidas químicos de síntesis que impiden la proliferación de estos patógenos postcosecha. Sin embargo, cada vez más, las objeciones de carácter higiénico-sanitarias impiden el uso de estos fungicidas, por lo que existe la necesidad de desarrollar nuevos y efectivos métodos antifúngicos de carácter natural que permitan la conservación y que sean aceptados por el consumidor debido a que no supongan un riesgo para la salud y el medio ambiente. En este sentido, los envases activos son uno de los más innovadores conceptos de envasado, desarrollados como alternativa a la utilización de sistemas de conservación tradicionales.

A diferencia de los envases tradicionales, a los que se exige que sean totalmente inertes, los activos están diseñados para interaccionar de forma activa y continua con su contenido. Esta interacción implica siempre una transferencia de masa, ya sea para incorporar sustancias al contenido del envase (el alimento y su entorno) o para absorber componentes del mismo, con el objeto de ampliar el tiempo de conservación, o bien de mejorar el estado de los alimentos.

La tecnología de envasado que se centra en efectos antimicrobianos es una de las más prometedoras en el ámbito de envases activos. Un envase antimicrobiano es un sistema capaz de inhibir el crecimiento de microorganismos alterantes, extendiendo así la vida útil del alimento (Han, 2000). Son muy diferentes las sustancias de origen natural que se pueden incorporar a un sistema de envasado para conferirle actividad antimicrobiana o antifúngica (Villalobos y col., 2016; Calo y col., 2015). En este sentido, la eficacia antimicrobiana de extractos de plantas y aceites esenciales liberados dentro del envase o recipiente en forma de compuestos volátiles ha sido ampliamente estudiada (Kapetanakou y Skandamis, 2016; Gyawalii y col., 2015). Entre las diferentes sustancias naturales que pueden incorporarse a un sistema de envasado para conferir actividad antimicrobiana se encuentran las semillas de mostaza, cuyo componente volátil activo, el alil isotiocianato (AITC), ha demostrado tener una mayor eficacia antimicrobiana que otros compuestos volátiles procedentes del orégano, la canela, el ajo o el clavo (Nazareth y col.,2016; Quiles y col., 2015)

En Extremadura, la fruticultura es un sector de gran incidencia que supone una facturación global superior a 350 millones de euros. En el caso del higo, más del 54% de la superficie cultivada en España se localiza en Extremadura (Anuario de estadística 2018, MAPA). Los higos son una fruta de temporada y se pueden consumir frescos o secos. Para su consumo en fresco, a pesar de ser un fruto climatérico, se deben cosechar cuando estén casi completamente maduros para asegurarse de que han desarrollado sus características organolépticas óptimas (Crisosto y col., 2011). Sin embargo, esto resulta en una rápida pérdida de calidad y vida útil, principalmente por ablandamiento, hendiduras y crecimiento de microorganismos como mohos, levaduras y bacterias (Villalobos y col., 2016), limitando su consumo principalmente a mercados locales. Por todo esto, y debido a una demanda creciente de los mercados, existe la necesidad de aumentar la vida postcosecha de esta fruta. 

El objetivo de este trabajo fue estudiar la liberación de AITC, agente antimicrobiano obtenido a partir de semillas de mostaza negra (Brassica nigra L.), y evaluar su efecto in vitro e in vivo sobre la capacidad de inhibir el crecimiento de Penicillium expansum, uno de los principales patógenos postcosecha del higo fresco.

Material y métodos

Las semillas de mostaza negra ( Brassica nigra L.), previamente desengrasadas, fueron trituradas en un molino de bolas a 350 rpm durante 30 minutos. El tamaño de partícula influye en la liberación del AITC, por lo que las partículas de semilla se cribaron con tamices de distinto paso de luz, llevándose a cabo el estudio con la fracción de mayor tamaño (>500 micras).

Para llevar a cabo el estudio in vitro, placas de agar patata dextrosa (PDA), inoculadas con 10 µL de una suspensión de esporas 105 ufc/mL de P. expansum, se colocaron en el interior de recipientes herméticos provistos de un septum para la toma de muestras, manteniéndose a temperatura de 25 ºC y una humedad relativa (HR) del 99% para favorecer el crecimiento del moho, en presencia de 50, 100 y 150 mg de semilla de mostaza. De forma paralela se prepararon recipientes herméticos con el microorganismo en las mismas condiciones de humedad y temperatura, sin la presencia de semilla, que se tomaron como tratamiento control. Los ensayos se realizaron por triplicado. Para determinar el efecto del AITC se midió el diámetro de la colonia resultante a las 48 y 96 h de la inoculación.

El AITC liberado se analizó mediante cromatografía de gases con microextracción en fase sólida (SPME) (Morra y Kirkegaard, 2002), tomando muestras a distintos intervalos de tiempo durante 96 h. Para ello, se utilizó un cromatógrafo de gases (Agilent 7890A) equipado con detector de ionización de llama (FID) y columna HP-1- methyl siloxane (30 m×0,25 mm d.i., 0,25 μm). La curva de calibración se llevó a cabo depositando cantidades conocidas de AITC en los recipientes que fueron analizadas de la misma forma que las muestras.

Para el estudio in vivo, se emplearon higos de la variedad 'San Antonio' (Ficus carica L) obtenidos de un campo experimental ubicado en el centro de investigación "Finca La Orden-Valdesequera" (Guadajira, Badajoz, España). Los higos fueron cosechados manualmente una vez alcanzada la madurez comercial y seleccionados en base a su tamaño y color. Posteriormente, fueron desinfectados mediante pulverización con una solución de hipoclorito sódico (100 ppm). Una vez secados a temperatura ambiente, fueron inoculados, previa incisión con una varilla esterilizada de acero inoxidable, con 20 µL de una suspensión de esporas (105 esporas/ml) de P. expansum . Los higos inoculados fueron envasados en recipientes de polietileno transparente (1500 cm3) junto con 50 mg de semilla de mostaza, y se almacenaron a 1 ºC y 99 % de humedad relativa. Al mismo tiempo, se almacenaron en las mismas condiciones de humedad y temperatura higos inoculados sin la presencia de semilla de mostaza (Tratamiento Control), e higos no inoculados para evaluar la susceptibilidad a la podredumbre de la variedad (Tratamiento S.P.). Diariamente se evaluó el porcentaje de frutos podridos.

Para el análisis estadístico de los datos se utilizó el programa IBM SPSS versión 20. Sobre los resultados obtenidos se aplicó un análisis de varianza Anova y un test de Tukey (p<0.05), en caso de existir diferencias significativas entre las medias.

Resultados

Al estudiar el efecto in vitro del AITC sobre el crecimiento de P. expansum, observamos que las concentraciones más bajas evitaron su desarrollo durante las 96 horas de duración del ensayo (Figura 1), mientras que en las placas control ya hubo crecimiento del moho a las 48 h.

Los perfiles de liberación del AITC de la semilla de mostaza negra (Brassica nigra L.) se resumen en la Figura 2. En dicha figura se puede observar como para las tres cantidades de semilla aplicadas (50, 100 y 150 mg), es aproximadamente a las 20 h cuando se alcanzan las mayores concentraciones de AITC (156.0±11.7, 357.0±39.6 y 513.7±35.3 ppb), para posteriormente disminuir progresivamente hasta llegar a valores de 23.5±12.6, 32.25±17.4 y 124.7±2.7 ppb de AITC respectivamente.

En el estudio in vivo, se observó que después de 13 días de almacenamiento el porcentaje de frutos podridos fue significativamente mayor (75%) en los higos inoculados del tratamiento control frente a los higos inoculados e incubados en presencia de 50 mg de semillas de mostaza (25%). Además, no se encontraron diferencias significativas entre el tratamiento S.P. (higos no inoculados) y los higos inoculados tratados después de 13 días de almacenamiento (Figura 3).

Varios autores han encontrado resultados similares, mostrando la eficacia del AITC en el retraso del crecimiento de Penicillium verrucosum, Aspergillus flavous y Aspergillus parasiticus (Quiles y col., 2019; Nazarethy col., 2019; Manyes y col., 2015). Además, Mari y col. (2008) también demostraron que la liberación de AITC de las plantas de Brassica podría ser una alternativa válida para controlar el desarrollo de Monilinia laxa en fruta de hueso.

Conclusión

Los resultados obtenidos en los ensayos in vitro e in vivo, han mostrado la eficacia del AITC liberado de semillas de mostaza negra ( Brassica nigra L.) frente a P. expansum. La concentración más baja de AITC probada mostró una reducción significativa de la infección sin presentar efectos fitotóxicos en los higos de la variedad ‘San Antonio’. Por tanto, estos resultados preliminares han puesto de manifiesto el potencial uso de AITC para prolongar la vida útil de los higos frescos.

Agradecimientos

Los autores agradecen a la Junta de Extremadura y a los fondos FEDER el apoyo económico (proyectos IB16190, GR10006 y GR18196).

Referencias

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Crisosto, C.H., Ferguson, L., Bremer, V. (2011). Fig (Ficus carica L.). In: Yahia, E.E. (Ed.). Posharvest Biology and Technology of Tropical and Subtropical Fruits. Cambridge, UK, pp. 134-158.

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