El defecto de hinchazón tardía en los quesos: causas y formas de prevención

Este problema que afecta  a los quesos, la hinchazón tardía, es un defecto propiciado por la fermentación butírica, que se produce por el crecimiento de bacterias del género Clostridium. Estas bacterias son capaces de fermentar el lactato presente en los quesos produciendo ácido butírico, ácido acético, dióxido de carbono e hidrógeno. Este mal, que tiene lugar en la etapa de maduración, es una de las principales causas del deterioro de los quesos, ya que produce graves alteraciones de textura, olor y sabor, con el consiguiente impacto económico en la industria quesera (Garde et al., 2011). El gas que se produce en la fermentación butírica en el interior de los quesos da lugar a agujeros irregulares y grietas, que en muchas ocasiones pueden llegar al exterior (Figura 1). Estos fallos de la estructura van acompañados normalmente de sabores y olores desagradables debidos a los compuestos que se producen en esta fermentación.

Los quesos más susceptibles de ser afectados por la hinchazón tardía son los de pasta dura y semidura. Entre ellos, podemos destacar algunas variedades de quesos de leche de vaca como el emmental, gouda, gruyer, eddam, grana padano y provolone (Nescier et al., 2015); aunque también se ha observado en quesos elaborados con leche de oveja, como el queso manchego (Garde et al., 2011).

La hinchazón tardía es la consecuencia de un proceso que comienza con la germinación y crecimiento de los esporos de bacterias anaerobias, principalmente Clostridios butíricos, que están presentes en la leche con la que se fabrica el queso. En las granjas lecheras se han identificado como las fuentes más importantes de estos esporos el suelo, los ensilados, las heces y el lecho de los animales. La ruta principal de contaminación de la leche con esporos de Clostridios butíricos se muestra en la Figura 2, donde se indican dos rutas o vías de contaminación que pueden tener lugar simultáneamente (Driehuis, 2013). La primera vía de contaminación comienza con la alimentación de los animales lecheros con ensilados contaminados con esporos, que tras atravesar el tracto gastrointestinal terminan en las heces y, por tanto, en el lecho de los espacios donde se encuentran. De esta manera, se contaminan sus ubres con los esporos, desde donde se transfieren a la leche durante el ordeño. La segunda vía de contaminación comienza en el suelo, que puede contaminar el exterior de las ubres con los esporos durante el pastoreo de los animales y pasar a la leche durante el ordeño, como en la vía anterior.

Los esporos germinan en el interior del queso cuando se alcanzan las condiciones adecuadas en la etapa de maduración (ausencia de oxígeno, alta humedad y concentración de sal inferior al 5%). Los esporos sobreviven al tratamiento de pasteurización de la leche y algunos incluso a la esterilización (Driehuis, 2013), aunque no constituyen un riesgo para la salud. El hecho de que se produzca la fermentación butírica depende del número de esporos que hay inicialmente en la leche cruda que, en general, suele ser bajo. En algunos estudios se han encontrado niveles de esporos de hasta 100 esporos/ml en leche de vaca (Driehuis et al., 2016) y de hasta 240 esporos/ml en leche de oveja (Garde et al., 2011). Sin embargo, algunos autores han indicado que cantidades tan pequeñas como 50 esporos/l son suficientes para que se pueda producir este defecto (López-Enríquez et al., 2007).

Clostridium tyrobutyricum es considerada la principal especie causante del defecto de hinchazón tardía en los quesos. Esta bacteria es Gram-positiva, anaerobia y esporulada. Se ha demostrado que otras especies de Clostridios como C. sporogenes, C. beijerinckii, C. butyricum y C. perfringens también pueden contribuir significativamente a la aparición del defecto de hinchazón tardía (Le Bourhis et al., 2007). Sin embargo, todavía no está clara la extensión de la contribución de cada especie, ni si otros géneros y especies también pudieran estar involucrados en este problema (Driehuis, 2013). Así, en quesos de la Denominación de Origen Queso Manchego con hinchazón, se identificó C. sporogenes en el 78,9% de los esporos aislados, C. beijerinckii en el 10,3%, C. tyrobutyricum en el 9,0% y C. butyricum en el 1,8% (Garde et al., 2011). Estos datos indican que la predominancia de unas determinadas especies de bacterias butíricas en los quesos afectados por la hinchazón tardía va a depender mucho del tipo de alimentación que se da a los animales lecheros y de la zona geográfica donde se encuentran.

Con el objetivo de prevenir el defecto de la hinchazón tardía, en primer lugar se deben tomar medidas para minimizar el contenido de esporos en la leche en las mismas explotaciones ganaderas, aplicando buenas prácticas en la fabricación de los ensilados, y con buenas medidas de higiene en el ordeño. Además, en las queserías se pueden aplicar tratamientos físicos a la leche para reducir el número de esporos, entre los que destacan la microfiltración y la bactofugación. Estos tratamientos, meramente físicos, disminuyen la carga de esporos de la leche pero no los eliminan al 100%, además de ser costosos energéticamente. Para aumentar su efecto, estas técnicas se suelen emplear en combinación con aditivos como los nitratos, la lisozima o las bacteriocinas (Brändle et al., 2016). Esta combinación permite que los aditivos se puedan emplear en menores cantidades, para cumplir la regulación establecida por la legislación europea (Reglamento (UE) nº 1129/2011).

Para evitar la utilización de aditivos químicos, se pueden adicionar también antimicrobianos naturales de origen animal como la lisozima, o de origen microbiano como las bacteriocinas (Brändle et al., 2016). La adición de lisozima (E-1105), obtenida de la clara de huevo de gallina, para prevenir la fermentación butírica se ha extendido mucho en los últimos años. Este enzima se agrega a la leche según el principio quantum satis (Reglamento (UE) nº 1129/2011) y es capaz de hidrolizar los enlaces glicosídicos β (14) de los polisacáridos de la pared celular de las células vegetativas de los Clostridios, una vez que los esporos germinan. El problema del empleo de la lisozima es que podría plantear riesgos en personas alérgicas al huevo y por ello, aunque no esté totalmente demostrado (EFSA, 2005; Iaconelli et al., 2008), su uso está prohibido en algunas variedades de queso con Denominación de Origen Protegida (Gómez Torres, 2017).

El problema principal de la detección de las leches contaminadas con esporos butíricos es que niveles muy bajos de estos pueden causar la hinchazón tardía. El método más utilizado en los laboratorios de control de calidad de la leche para la detección de los Clostridios butíricos es el cultivo en medio líquido y la interpretación por medio del procedimiento del “Número Más Probable” (NMP), basado en detectar la formación de gas en réplicas de tubos inoculados con diluciones seriadas de la muestra. Los inconvenientes que presenta el NMP son el prolongado tiempo de incubación de las muestras necesario (7 días) y la laboriosidad e imprecisión del método, ya que pueden aparecer tanto falsos positivos por la presencia de microorganismos productores de gas resistentes al tratamiento térmico que se aplica previamente al cultivo, como falsos negativos si el tiempo de incubación no ha sido suficiente para que se produzca la germinación. Se debe tener en cuenta que este método solo permite una estimación del número de esporos dentro de ciertos límites de confianza y, por lo tanto, no refleja el número real de esporos presentes en las muestras, ni las especies de bacterias causantes de la formación de gas.

Se ha desarrollado recientemente un método semiautomático basado en la técnica del NMP realizando diluciones seriadas en un medio selectivo mejorado con un indicador de color para la identificación de las diluciones positivas, en lugar de medir la producción de gas como en el NMP clásico (Brändle et al., 2018). Con esta técnica se consiguió detectar y cuantificar los esporos butíricos reduciendo el tiempo de incubación de las muestras de leche a 48 horas y obteniendo un límite de detección de 75 esporos/l.

Métodos de detección

En nuestro grupo de investigación, en colaboración con la empresa Zeulab (Zaragoza, España), hemos abordado diferentes aproximaciones con el objetivo de desarrollar un método que acorte los tiempos de detección de los Clostridios butíricos. En un primer estudio, seleccionamos péptidos específicos afines por los esporos de C. tyrobutyricum (Lavilla et al., 2009), utilizándolos como ligandos unidos a esferas magnéticas como una etapa de enriquecimiento (Lavilla et al., 2012). En otro estudio investigamos la posible aplicación de la citometría de flujo combinada con el uso de anticuerpos policlonales específicos frente a C. tyrobutyricum conjugados con fluorocromos (Lavilla et al., 2010). Esta técnica permitió detectar esporos de C. tyrobutyricum en leche de vaca en 2 horas, con un límite de detección de 10³ esporos/100 ml de leche. A pesar de que estos métodos son más rápidos que los de tipo microbiológico, tienen límites de detección todavía demasiado altos.

Para la aplicación de la técnica de la PCR a tiempo real hemos evaluado diferentes métodos para extraer el ADN de los esporos (Esteban et al., 2020). Actualmente, estamos desarrollando un método rápido para la detección y cuantificación de los esporos butíricos combinando la extracción y purificación del ADN de los esporos de C. tyrobutyricum mediante un sistema que utiliza partículas magnéticas, con la cuantificación por PCR a tiempo real. Para comprobar la aplicabilidad del nuevo método y validarlo, se están analizando muestras de leche cruda de vaca, oveja y cabra, de diferente procedencia geográfica, sospechosas de contaminación con Clostridios butíricos. Los resultados obtenidos se están comparando con los obtenidos por cultivo microbiológico.

Asimismo, estamos investigando en la identificación a nivel de especie de los microorganismos causantes de la fermentación butírica, con el objetivo de comprobar si se trata exclusivamente de contaminación por C. tyrobutyricum o existen otras especies presentes que pudieran producir el defecto de hinchazón tardía. Aunque somos conscientes de que la detección y cuantificación de los esporos de las bacterias causantes de la fermentación butírica es un tema complejo, esperamos que se pueda disponer pronto de un método para que los laboratorios de control de calidad de la leche sean capaces de determinar en un tiempo breve si una leche es apta o no para la elaboración de quesos de maduración larga.