Alteraciones microbiológicas en vino y cava: quiénes las producen y cómo detectarlas

La transformación de mosto de uva en vino es un proceso ecológico y bioquímico complejo que implica el desarrollo secuencial de especies microbianas tales como levaduras, bacterias lácticas y bacterias acéticas (Pretorius, 2000). Cualquiera de estos microorganismos es susceptible de producir bien efectos positivos en el vino o cava o bien alteraciones no deseables dependiendo de la etapa de la que se trate y en qué cantidad se encuentren.

El número de levaduras en la uva, justo antes de la cosecha, varía de 103 a 106 células/ml (Romano et al., 2006) en función de las variedades de uvas, las condiciones climáticas, prácticas vitícolas, etapa de maduración, el daño físico (causada por hongos, insectos y aves) y fungicidas aplicados a los viñedos (Pretorius et al., 1999). Aunque el mosto de uva es relativamente completo en cuanto a nutrientes, el bajo pH y el alto contenido en azúcar determinan que solo unas pocas bacterias y especies de levaduras puedan crecer. Además, la adición de dióxido de azufre, principal compuesto antioxidante y antimicrobiano, impone una selección adicional, principalmente contra bacterias y levaduras con menor poder fermentativo.

Durante la fermentación alcohólica (FA), las levaduras son las verdaderas protagonistas (levaduras no-Saccharomyces al principio y Saccharomyces posteriormente), mientras que la contribución de bacterias lácticas y acéticas a la fermentación alcohólica es considerada nula y su desarrollo suele estar ligado a alteraciones

Otro factor importante es la restricción creada por las condiciones anaeróbicas una vez iniciada la fermentación. Al inicio de esta, las especies de levaduras predominantes pertenecen a las denominadas no-Saccharomyces de los géneros Hanseniaspora, Candida, Pichia, Metschnikowia, Kluyveromyces, Zygosaccharomyces, Torulaspora, Starmerella, Dekkera y Schizosaccharomyces. Por el contrario, la población de la principal levadura vínica Saccharomyces cerevisiae en el mosto es muy baja. Las no- Saccharomyces proliferan en los primeros días de fermentación hasta poblaciones aproximadamente de 106-107 células/ml. Sin embargo, durante la fermentación alcohólica el aumento de la concentración de etanol, el agotamiento de nutrientes claves como el nitrógeno y el aumento constante de la temperatura de fermentación favorecen la rápida proliferación de las cepas de S. cerevisae, llegando a alcanzar poblaciones entre 5x107-108 ufc/ml en detrimento de estas otras especies mayoritarias en el mosto de uva (Goddard, 2008; Salvadó et al, 2011). En ocasiones, algunas levaduras como Brettanomyces, Kluyveromyces, Schizosaccharomyces, Torulas­pora y Zygosaccharomyces aparecen en fases finales de la fermentación alcohólica. Sin embargo, esta presencia suele ir asociada a fermentaciones problemáticas y que acaban en alteraciones de la calidad del vino final.

Así pues, durante la fermentación alcohólica (FA), las levaduras son las verdaderas protagonistas (levaduras no-Saccharomyces al principio y Saccharomyces posteriormente), mientras que la contribución de bacterias lácticas y acéticas a la fermentación alcohólica es considerada nula y su desarrollo suele estar ligado a alteraciones. Sin embargo, a pesar de que no haya proliferación, sí que hay supervivencia de bacterias (recuentos de 102 a 104 ufc/ml en el mosto) y, después de la fermentación alcohólica, hay un crecimiento de las poblaciones de bacterias lácticas supervivientes (hasta 107 ufc/ml) que llevarán a cabo la fermentación maloláctica (FML), que consiste en la transformación del ácido málico presente de forma natural en el vino en ácido láctico y CO₂. Tan pronto como el ácido málico se transforma completamente a ácido láctico, esta población de bacterias comienza a declinar. No obstante, si el vino no está suficientemente sulfitado después de la FML, estas bacterias permanecen durante meses.

La presencia de bacterias acéticas depende mayoritariamente de la calidad sanitaria de la uva de origen. Uvas podridas, por exceso de lluvias, o contaminadas con Botrytis cinerea producen mostos con poblaciones muy elevadas de acéticas

Durante la FML, las alteraciones que pueden producirse en el vino dependen fundamentalmente de la existencia de sustratos capaces de ser metabolizados en ese momento por las bacterias lácticas, por levaduras residuales que hayan sobrevivido a la FA o por las bacterias acéticas. Un vino en el que se han consumido todos los azúcares durante la FA presenta una probabilidad de sufrir alteraciones muchísimo más bajas que aquellos en los que se ha producido una parada de fermentación o en los que ha quedado una cierta cantidad de azúcares residuales que no han podido ser consumidos por las levaduras. Las bacterias acéticas también pueden estar presentes durante la fermentación tanto alcohólica como maloláctica. Su presencia depende mayoritariamente de la calidad sanitaria de la uva de origen. Uvas podridas, por exceso de lluvias, o contaminadas con Botrytis cinerea producen mostos con poblaciones muy elevadas de acéticas. En el mosto, las especies mayoritarias son Gluconobacter oxydans, Acetobacter aceti y A. pasteurianus, y, en menor medida, Gluconacetobacter liquefaciens y Ga. hansenii (González et al., 2005), que son las aisladas mayoritariamente también en la uva.

Durante la fermentación alcohólica, como consecuencia de las fuertes condiciones de anaerobiosis impuestas por el metabolismo de las levaduras, y la alta dependencia del oxígeno que presentan las acéticas para su desarrollo, las posibilidades de proliferación son prácticamente nulas. Sin embargo, estas bacterias son mucho más resistentes al sulfuroso, bajo pH, etanol, etc., que las bacterias lácticas. De manera que al final de la fermentación alcohólica presentan poblaciones todavía elevadas, que pueden proliferar si las condiciones de almacenamiento o crianza del vino no son las adecuadas, fundamentalmente sulfitado correcto y almacenamiento en atmósferas anaerobias. Si proliferan las bacterias acéticas, el vino final se altera con presencia de ácidos acéticos producidos por el metabolismo de las mismas.

Por último, Brettanomyces bruxellensis ha sido caracterizada históricamente como la principal levadura contaminante responsable de la formación de fenoles volátiles como el 4-etilfenol, 4-etilguaiacol y tetrahidropiridinas, que producen aromas desagradables y que alteran el vino, sobre todo en las etapas de la crianza del vino y embotellado donde las poblaciones de esta levadura aumentan de manera lenta pero sin competencia, originando los principales riesgos.

En el caso del cava, parte de los problemas descritos anteriormente no serían aplicables porque el mosto original sufre filtraciones que bajan la carga microbiológica inicial disminuyendo el riesgo de contaminación. Sin embargo, también se tiende a añadir poca cantidad o ninguna de sulfito, lo que puede dar problemas de aparición de bacterias lácticas y refermentaciones en botellas.

Cómo detectar los microorganismos alterantes

El sector vinícola necesita técnicas rápidas y prácticas para la monitorización y detección de microorganismos que causan el deterioro del vino o el cava en cualquiera de sus etapas de fabricación y almacenado, para evitar las consecuentes pérdidas económicas. Tanto levaduras como bacterias, pueden ser responsables de la contaminación del vino o cava y su fuente primordial suele ser el propio ambiente de la bodega.

La utilización de técnicas moleculares basadas en el material genético supone una ventaja respecto a las técnicas clásicas basadas en el cultivo, pues no es necesario este para la detección y son más sensibles a la hora de detectar cierto microorganismo

A pesar de que, en muchas ocasiones, se ha podido establecer una relación directa entre especies alterantes y alteraciones específicas del vino, esta no ha sido siempre la situación real, dándose deterioro del vino con poblaciones muy bajas de especies deteriorantes conocidas hasta el momento (incluso, en casos en los que no se detectan). Asimismo, no se conocen con precisión las razones por las que una determinada población alterante se desarrolla en un momento determinado en una tina de fermentación, barrica o botella de cava mientras que en otras del mismo origen y con las mismas condiciones no manifiesta dicha población. Entre las razones plausibles se podría considerar que las comunidades microbianas en cada tina, barrica o botella han evolucionado de forma diferente y la interacción con otros microorganismos podría favorecer el desarrollo de las poblaciones alterantes. Este hecho dificulta la predicción de la posible contaminación y su control.

Tradicionalmente, la detección de los microorganismos que alteran el vino se ha realizado mediante técnicas dependientes de cultivo o análisis sensoriales. Sin embargo, algunos microorganismos no son capaces de crecer en los medios empleados o tienen un crecimiento lento, lo cual alarga la detección. Por otro lado, al igual que los métodos sensoriales, los métodos basados en el cultivo de microorganismos suelen ser confirmativos, dificultando una acción de previsión. Recientemente, la utilización de técnicas moleculares basadas en el material genético supone una ventaja respecto a las técnicas clásicas basadas en el cultivo, pues no es necesario este para la detección y son más sensibles a la hora de detectar cierto microorganismo. No obstante, el material y conocimiento necesario para llevar a cabo las técnicas moleculares no está siempre al alcance de una bodega pequeña o mediana.

Las técnicas más usuales a nivel de bodega, en la actualidad, son la observación al microscopio, cultivo en placas de medio selectivo o general, análisis sensoriales, cromatografía de gases, análisis de PCR y luminómetros. Estos últimos son equipos de bioluminiscencia basados en la detección del ATP (adenosine triphosphate), que es la molécula energética por excelencia y se encuentra en todos los organismos vivos, con lo que su cuantificación sería proporcional a la presencia de organismos con actividad metabólica. El análisis mediante luminómetros de las muestras tomadas de las superficies de las bodegas mediante hisopos o bastoncillos estériles sería una buena indicación de presencia o ausencia de microflora, siendo un método rápido para monitorizar la eficiencia en la limpieza de equipos y superficies, aunque los microorganismos específicos quedarían sin identificar.

Las técnicas más usuales a nivel de bodega, en la actualidad, son la observación al microscopio, cultivo en placas de medio selectivo o general, análisis sensoriales, cromatografía de gases, análisis de PCR y luminómetros

Las técnicas moleculares utilizadas para la detección y estudio de microorganismos en el vino incluyen análisis como la restricción del ADN mitocondrial (Martorell et al., 2006), PCR-RFLP (Dias et al., 2003; Esteve-Zarzoso et al., 1999), PCR-RAPD (Martorell et al., 2006), PCR con cebadores específicos (Campolongo et al., 2010) y PCR anidada (Ibeas et al., 1996). Sin embargo, muchas de estas técnicas necesitan un paso de enriquecimiento previo para extraer el ADN de forma que son técnicas semi-cuantitativas. Por ello, se está tendiendo al uso de qPCR (PCR cuantitativa) para la detección específica y cuantificación directa de microorganismos contaminantes del vino como B. bruxellensis. Aunque estas técnicas reducen el tiempo de análisis con respecto a las técnicas de cultivo y detectan incluso las células VPNC, al usar el ADN, se detectan tanto células vivas como muertas, pudiendo dar lugar a una sobreestimación del número de levaduras en la muestra (Andorrà et al., 2010).

Gracias a la introducción del bromuro monoazódico de etidio (EMA) o bromuro moazódico de propidio (PMB) combinados con la qPCR se han podido detectar únicamente las células vivas (Andorrà et al., 2010). Sin embargo, es necesario optimizar la concentración de EMA para ensayos diferentes y la concentración de etanol afecta los resultados (Andorrà et al., 2010). El ARN es considerado como un buen indicador de viabilidad ya que se degrada más rápidamente que el ADN (Ivey y Phister, 2011) aunque también es dependiente del gen usado para la detección. El problema principal de la qPCR, a partir tanto de ADN como de ARN, es que la qPCR sólo detecta y cuantifica los microorganismos diana para los cuales hayamos diseñado cebadores de amplificación específicos y, en la actualidad, se desconoce si dichos microorganismos son los únicos implicados en el deterioro del vino.

Nuevas técnicas moleculares

Una nueva técnica molecular que puede emplearse para el estudio de la diversidad microbiana es la secuenciación masiva o HTS (de sus siglas en inglés high throughput sequencing). Consiste en la ordenación de miles de secuencias por cada muestra tras la extracción directa de ácidos nucleicos de la matriz que se esté estudiando, en nuestro caso el vino o cava. Existen diferentes tecnologías de secuenciación masiva (Shendure and Ji, 2008) cada una con sus ventajas y desventajas (Suzuki et al., 2011; Liu et al., 2012). El estudio de la composición microbiana se realiza de forma habitual mediante la amplificación de genes de interés taxonómico (normalmente el gen ARNr 16S para bacterias y el gen de ARNr 18S o el ITS para hongos) y puede ofrecer la proporción de los distintos grupos taxonómicos dentro de un alimento mediante la secuenciación de estos genes y su comparación con las bases de datos de referencia que proporcionarán la identificación de las distintas secuencias con lo que, además, tiene carácter cuantitativo.

Una nueva técnica molecular que puede emplearse para el estudio de la diversidad microbiana es la secuenciación masiva o HTS, consiste en la ordenación de miles de secuencias por cada muestra tras la extracción directa de ácidos nucleicos de la matriz

En los últimos años la secuenciación masiva se ha aplicado en prácticamente todos los campos de investigación de microbiología incluidos estudios sobre alimentos aunque el coste de estos análisis y el requerimiento de habilidades específicas bioinformáticas aún limitan su aplicación industrial. Muchos de estos estudios tenían un marcado carácter de ecología microbiana (revisado en Ercolini, 2013) y, recientemente, se ha puesto de manifiesto la capacidad y potencial de estas técnicas de HTS para poder detectar contaminaciones en alimentos y su posible trazabilidad en el entorno en el cual se procesan dichos alimentos (De Filippis et al., 2013). Hay que recordar que en muchos alimentos existen microorganismos pertenecientes al mismo género y en estos casos los estudios de HTS basados en secuencias muy cortas a nivel de género no serían de utilidad para diferenciar entre dichas especies. En estos casos, para obtener información a nivel de especie habría que tener como diana fragmentos más largos incluyendo más regiones variables de los genes taxonómicos o bien complementar la técnica de HTS con alguna técnica de tipificación de especies como la RFLP (por ejemplo, Bokulich et al., 2012).

La ventaja indudable que las técnicas HTS aportarían al estudio de la contaminación microbiana del vino o cava es que, al obtener miles de secuencias para una única muestra, se puede tener una descripción detallada de los microorganismos presentes en el deterioro y el cambio poblacional previo a la proliferación de un determinado microorganismo responsable de la alteración, con lo que podría tener carácter predictivo. Además, las técnicas HTS pueden procesar cientos de muestras simultáneamente y se pueden realizar tanto a partir de ADN como de ARN, con lo que se podría tener información tanto de los microorganismos presentes, como los metabólicamente activos en el momento del deterioro, respectivamente. Por otro lado, mediante la metatranscriptómica (secuenciación masiva de todos los genes que se están transcribiendo en un determinado momento) se podría tener información de las interacciones metabólicas entre los distintos microorganismos implicados en el deterioro del vino. Todas estas técnicas basadas en secuenciación masiva, sin duda ofrecen una oportunidad para un estudio más detallado de los microbios responsables de la fermentación del vino y en su caso, de su posible deterioro.

Aunque las técnicas HTS no sean aplicables a corto plazo por las bodegas como rutina, debido a los elevados costes de inversión en la tecnología necesaria y el grado de conocimiento específico que se necesita para realizar dicho análisis e interpretación de datos, sí que se pueden desarrollar servicios a bodegas para que realicen análisis periódicos de poblaciones en vinos de crianza y así poder prevenir posibles contaminaciones microbianas.

Mª del Carmen Portillo Guisado (BIOTENOL - Biotecnologia Enológica) - Departamento de Bioquímica y Biotecnología - Universitat Rovira i Virgili

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