Virus de transmisión alimentaria: relevancia y métodos de detección

Los microorganismos patógenos se encuentran entre los principales riesgos sanitarios asociados al consumo de alimentos y, por ende, repercuten en la seguridad alimentaria. Recientemente, la organización mundial de la salud ha elaborado un informe según el cual se estima que los microorganismos patógenos son responsables de 600 millones de casos de enfermedades de transmisión alimentaria y de 420.000 muertes anuales. Según este informe, la enfermedad más común es la gastroenteritis (550 millones de casos), causada principalmente por los norovirus humanos (120 millones) y Campylobacter spp. (96 millones) (WHO, 2015).

Los virus de transmisión alimentaria, o virus entéricos, son responsables de diversas patologías desde gastroenteritis, normalmente leves, hasta patologías más graves como hepatitis agudas, miocarditis o incluso meningitis o encefalitis aséptica. En los últimos años, se ha producido un aumento en el número de brotes de transmisión alimentaria causados por estos patógenos. Esto supone un importante problema de salud pública, ocasionando graves incidencias sanitarias en algunos grupos de población, como personas inmunodeprimidas o ancianos además de tener importantes repercusiones económicas.

Unos de los virus de transmisión que más preocupan hoy en día en seguridad alimentaria son los norovirus humanos (NoV), causantes de gastroenteritis, el virus de la hepatitis A (HAV), y más recientemente el virus de la hepatitis E (HEV) que causan cuadros de hepatitis agudas. Según los últimos datos publicados en Estados Unidos y Europa, los NoV son el primer agente causal de enfermedades de transmisión alimentaria (responsables etiológicos del 36% y 9,8% de los brotes, respectivamente), y se sitúan entre los cinco patógenos responsables de las enfermedades de transmisión alimentaria que suponen un mayor coste económico.

Los virus entéricos son transmitidos principalmente por la vía fecal-oral y, por tanto, pueden estar potencialmente presentes en alimentos que hayan sufrido contaminación directa con materia fecal, o a través de aguas contaminadas. Los principales alimentos involucrados en infecciones víricas transmitidas por alimentos son los moluscos bivalvos, las verduras y ensaladas, las frutas tipo baya, así como también los alimentos preparados y listos para su consumo que hayan sido contaminados por manipulación incorrecta después de su preparación o cocinado. Por otra parte, recientemente se ha demostrado un aumento de la incidencia de casos de hepatitis E asociado al consumo de productos cárnicos y sus derivados (Kupferschmidt, 2016).

La importancia de los virus entéricos en el campo de la seguridad alimentaria se pone de manifiesto por el interés mostrado por distintos organismos internacionales. Entre ellos destaca la comisión del Codex Alimentarius, que publicó un documento sobre la importancia de los virus de transmisión alimentaria. En dicho documento se pone de manifiesto la relevancia de desarrollar ciertos aspectos científicos y técnicos con la finalidad de reducir las infecciones víricas transmitidas por los alimentos. El plan estratégico a seguir menciona la necesidad de desarrollar métodos rápidos de diagnóstico, estudios para establecer la correlación entre infectividad y detección molecular y, finalmente, estudios sobre la efectividad de los procesados alimentarios para la inactivación de virus entéricos (CX/FH 08/40/9).

La localización de virus en alimentos se ha visto incrementada exponencialmente en los últimos años, estableciéndose métodos de detección basados en técnicas moleculares

En este sentido, la Agencia Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA) también ha publicado diversas directrices sobre la relevancia y el control de virus en alimentos; en línea con las directrices sobre principios generales de higiene para el control de virus en alimentos (CX/FH 10/42/5) elaboradas por la comisión Codex. En estos documentos se subraya que el control de los riesgos en alimentos debe empezar durante la producción agrícola o animal y continuar durante toda la cadena alimentaria (“de la granja a la mesa”). En este aspecto, los virus de transmisión alimentaria requieren especial atención debido a que se comportan de manera diferente a los patógenos bacterianos, y las medidas de control implementadas actualmente en la industria alimentaria no han sido evaluadas o no son efectivas para la inactivación de virus entéricos. En el campo de la seguridad microbiológica de los alimentos es necesario, por tanto, conocer el riesgo real que supone la presencia de los virus entéricos en los alimentos, así como aquellas condiciones que garanticen la seguridad microbiológica del alimento.

Métodos para la detección de virus en alimentos

La detección de virus entéricos es especialmente compleja ya que la mayoría de estos patógenos no replican fácilmente en cultivos celulares, en general se encuentran en concentraciones muy bajas, la contaminación vírica puede no ser uniforme y los virus entéricos pueden encontrarse internalizados en los alimentos. La localización de virus en alimentos se ha visto incrementada exponencialmente en los últimos años, estableciéndose métodos de detección basados en técnicas moleculares, principalmente RT-qPCR cuya normalización (ISO 15216-1:2017 y ISO/TS 15216-2:2013) y validación (Lowther et al., en prensa) en determinadas matrices (agua embotellada, superficie de alimentos, moluscos bivalvos, frutos rojos y hortalizas de hoja) han sido recientemente publicadas para NoV genogrupo I y II, y HAV.

Desafortunadamente, hasta la fecha, no existen métodos estandarizados para la detección y cuantificación del HEV en muestras de alimentos, a pesar de ser una de las prioridades establecidas recientemente por la agencia europea de seguridad alimentaria (EFSA, 2017). El análisis de virus en alimentos consiste en una etapa inicial de separación de los virus de la matriz alimentaria, seguido de la concentración de virus y purificación, diseñada para reducir el volumen de muestra y eliminar algunos de los compuestos de la matriz mientras que simultáneamente se recupera la mayor parte de los virus contaminantes. Posteriormente, se realiza la extracción de ácidos nucleicos, y detección y cuantificación mediante RT-qPCR.

El plan estratégico documentado por la Comisión del Codex menciona la necesidad de desarrollar métodos rápidos de diagnóstico, estudios de correlación entre infectividad y detección molecular y estudios sobre la efectividad de los procesos alimentarios para la inactivación de virus

La metodología descrita en las ISO 15216-1:2017 y ISO/TS 15216-2:2013 incluyen diversos controles para evaluar la presencia de inhibidores y determinar la eficacia del proceso de extracción mediante el uso de un control de proceso, generalmente el mengovirus. Todo ello hace que el análisis de virus en alimentos tenga un coste económico elevado. A pesar de esto, el método ISO se está utilizando en laboratorios de control de aguas y alimentos; y, actualmente, diversos laboratorios nacionales han acreditado estos procedimientos por ENAC.

Además, estos procedimientos están siendo utilizados a nivel fronterizo para la inspección de alimentos de riesgo por contaminación vírica, y durante el periodo 2017-2018 se ha informado de 81 alertas de contaminación por virus entéricos en el sistema de alerta rápida para alimentos y piensos (RASFF, https://webgate.ec.europa.eu/rasff-window/portal/?event=SearchForm&cleanSearch=1), 94 de ellas causadas por NoV y 6% por HAV. Los moluscos bivalvos han protagonizado la mayoría de las alertas publicadas (73%); mientras que los frutos rojos han originado un 23% de las alertas y las hortalizas (4%).

Por otro lado, estos métodos son rápidos, sensibles y altamente específicos, pero al detectar genomas no son capaces de diferenciar entre virus infecciosos y no infecciosos, y ello dificulta enormemente la interpretación de un resultado positivo en términos de análisis de riesgo. Con el fin de obtener una mejor correlación entre la detección por RT-qPCR y la infectividad de la muestra se han investigado distintas aproximaciones:

1. Recuperación de NoV potencialmente infecciosos unidos selectivamente a mucina gástrica porcina
2. Tratamientos con nucleasas y / o enzimas proteolíticas antes de la extracción para eliminar cualquier señal de cápsides dañadas
3. PCR de fragmentos largos
4. Tratamientos con reactivos de viabilidad, ya sea con un paso de fotoactivación (por ejemplo, propidio y etidio de monoazida; PMA o EMA) o sin fotoactivación (por ejemplo, compuestos de platino y paladio).

Esta última aproximación, l a PCR de viabilidad, se ha descrito para distintos virus entéricos inactivados por calor, tratamiento con cloro, luz ultravioleta o altas presiones (Tabla 1), y en los últimos años se han utilizado para la detección de estos patógenos en muestras de contaminación natural, principalmente muestras de agua. Además, distintos estudios han demostrado el potencial de estos procedimientos en muestras de vegetales y marisco.

A pesar de las mejoras incorporadas en los protocolos de PCR de viabilidad, la correlación con infectividad sigue sin ser absoluta dependiendo del virus o del tratamiento de inactivación aplicado. A pesar de ello, incorporar estos procedimientos en los análisis de rutina permitirá una cuantificación más precisa de los virus infecciosos presentes en los alimentos, que constituye una herramienta muy útil para la evaluación de riesgos. Por otro lado, el uso de las técnicas de secuenciación masiva en muestras de aguas y alimentos presenta un gran potencial tanto para la detección como para la identificación de secuencias víricas en aguas y alimentos.

Referencias:
-CroCoudray-Meunier, C., Fraisse, A., Martin-Latil, S., Guiller, L., Perelle, S. 2013. Discrimination
of infectious hepatitis A virus and rotavirus by combining dyes and surfactants with RT-qPCR. BMC Microbiology 13, 216–231.
-Fuster, N., Pinto, R.M., Fuentes, C., Beguiristain, N., Bosch, A., Guix, S. 2016. Propidium monoazide RTqPCR assays for the assessment of hepatitis a inactivation and for a better estimation of the health risk of contaminated waters. Water Research 101, 226–232.
-Kupferschmidt, K. 2016. Europe’s New Hepatitis Problem. Science 353, 862-863.
-Lowther, J.A., Bosch, A., Butot, S., Ollivier, J., Made, D., Rutjes, S.A., Hardouin, G., Lombard, B., In’t Veld, P., Leclercq, A. Validation of ISO method 15216 part 1 - Quantification of hepatitis A virus and norovirus in food matrices. International Journal of Food Microbiology doi: 10.1016/j.ijfoodmicro.2017.11.014
-Moreno, L., Aznar, R., Sánchez, G. 2015. Application of viability PCR to discriminate the infectivity
of hepatitis A virus in food samples. International Journal of Food Microbiology 201, 1–6.
-Randazzo, W., D’Souza, D.H., Sánchez, G. 2018a. Norovirus: the burden of the unknown. En “Emerging Risks in Food Safety” (ISSN: 978-0-12-813977-6) pp. 13-54.
-Randazzo, W., Piqueras, J., Rodríguez-Díaz, J., Aznar, R., Sánchez, G. 2018b. Improving efficiency of viability-PCR for selective detection of infectious HAV in food and water samples. Journal of Applied Microbiology 124, 958-964.
-Randazzo, W., Vasquez, A., Aznar, R., Sánchez, G. 2018c. Viability RT-qPCR to distinguish between HEV and HAV with intact and altered capsids. Frontiers in Microbiology 9:1973. doi: 10.3389/fmicb.2018.01973
-Sánchez, G., Elizaquível, P., Aznar, R. 2012. Discrimination of infectious hepatitis A viruses
by propidium monoazide real-time RT-PCR. Food and Environmental Virology 4, 21–25.
-World Health Organization. (2015). WHO estimates of the global burden of foodborne Diseases: Foodborne disease burden epidemiology reference group 2007-2015.