La microbiota del Parque Nacional de Ordesa en una cerveza ambiciosa

La variedad de ecosistemas de este parque nacional ofrece una elevada biodiversidad y exige un plan de trabajo complejo para abordar este primer estudio. El proyecto decidió evaluar nueve hábitats representativos y diferenciados del Parque Nacional (roquedo, bosque mixto de galería, bosque mediterráneo, bosque quejigo, pastos subalpinos, glera y pasto pedregoso, bosque de pino negro, bosque galería y hayedo-abetal). De esos hábitats se recogieron 45 muestras de diferentes plantas, árboles y suelos ricos en materia orgánica. A partir de estas muestras, mediante técnicas de microbiología clásica y biología molecular, CNTA aisló e identificó la microbiota (bacterias, levaduras y mohos) presente en las hojas, cortezas, tierra, flores, y frutos de estos hábitats. Se trata del primer estudio, hasta el momento, sobre la microbiota del Parque Nacional, identificando con ello la “vida” que no se ve a simple vista.

Considerando su posible aplicación en la industria cervecera, CNTA caracterizó, de entre todos los microorganismos identificados, el metabolismo de las principales especies de levaduras y bacterias lácticas (BAL) aisladas. De este modo y mediante pruebas de fermentación a escala de laboratorio, se evaluó la posibilidad de que estos microorganismos fueran capaces de conducir fermentaciones de interés para la elaboración de alimentos, en especial cerveza. A continuación, los productos de fermentación producidos se analizaron sensorial y físico-químicamente lo que permitió definir la estrategia de fermentación y el microorganismo más adecuado para, tras incluirlos en el proceso de elaboración tradicional, obtener una cerveza con aromas y características sensoriales diferenciales representativas del Parque Nacional de Ordesa y Monte Perdido.

Caracterización microbiológica de las muestras vegetales

La caracterización microbiológica de las muestras tomadas en cada uno de los ocho hábitats se realizó desde el punto de vista tanto cuantitativo, empleando técnicas de microbiología clásica (recuento microbiológico en agares selectivos para BAL y levaduras), como cualitativo mediante técnicas de biología molecular (secuenciación masiva y secuenciación tipo Sanger).

Los recuentos microbiológicos (BAL y levaduras) fueron variables en las diferentes muestras de los ocho hábitats analizados. Específicamente, los recuentos para las levaduras oscilaron entre 105-107 UFC/g, mientras que para las BAL los recuentos obtenidos fueron menores y estuvieron en torno a 103-106 UFC/g. Independiente del hábitat analizado, los recuentos microbiológicos fueron siempre superiores para las muestras de flores y frutos e inferiores para las muestras vegetales de cortezas y/o resinas (en torno a 2 ciclos logarítmicos).

Las especies de levaduras cultivables identificadas de forma más frecuente en las muestras vegetales fueron: Metschnikowia reukaufii, M. gruessii, Rhodotorula flavescens, R. fujisanensis, R. diobovata. Si bien ninguna de ellas está recogida actualmente en la lista de microorganismos QPS (Qualified Presumption of Safety) de la EFSA (European Food Safety Authority), algunas especies de levaduras del género Metschnikowia (M. pulcherrima) ya son comercializadas por grandes distribuidores de cultivos iniciadores de fermentación y tienen aplicación en la industria enológica (Flavia MP346 Lallemand®). Respecto a las principales especies de BAL cultivables identificadas, cabe destacar: Lactococcus lactis, Leuconostoc mesenteroides, Fructobacillus pseudoficulneus, F. tropaeoli y Lactobacillus sanfranciscensis. Las BAL forman parte la microbiota habitual implicada en múltiples procesos fermentativos como la producción de vino, pan, queso, kombucha o algunas cervezas especiales.

Microorganismos aptos como starters de fermentación

Una vez aisladas e identificadas los principales géneros y especies de BAL y levaduras salvajes, CNTA procedió, tal y como se ha indicado, a evaluar su crecimiento, de forma individual, en un medio sintético de laboratorio denominado medio malta (glucosa, extracto de malta y peptona) que pretendía simular los nutrientes y el pH característicos del mosto de malta (sustrato de fermentación para la fabricación de cerveza). La evolución de la fermentación “dirigida” por cada microorganismo se monitorizó mediante el seguimiento del valor de pH y la evolución del crecimiento microbiano mediante densidad óptica (DO; absorbancia 620 nm). Además, y para el caso concreto de las levaduras, se determinó el grado de floculación (porcentaje de levaduras en suspensión) y su capacidad de crecimiento en medio de malta con concentraciones crecientes de etanol (3%, 6%, 9% y 12% v/v).

Respecto a las levaduras evaluadas, si bien todas ellas fueron capaces de crecer en el medio malta, las pertenecientes al género Metschnikowia presentaron un crecimiento superior a las del género Rhodotorula y dentro de primeras, la especie M. reukafii fue la que alcanzó mayores valores de DO. Además, esta especie de levadura fue la que mayor crecimiento presentó cuando el medio malta fue suplementado con un 3% (v/v) de etanol. Resaltar que M. reukaufii fue aislada a partir de Petrocoptis crassifolia un endemismo pirenaico.

En relación a las BAL, de todas las cepas analizadas, L. lactis fue la bacteria que mayor DO alcanzó en el medio de malta (mayor crecimiento) y que fue capaz de producir una mayor acidificación del medio de cultivo (pH en torno a 4) por lo que fue la bacteria seleccionada. Cabe destacar que esta cepa también fue aislada de otro endemismo pirenaico, Ramonda myconi (en la imagen de apertura).

Microfermentaciones cerveceras

En las fermentaciones a escala de laboratorio utilizando como sustrato el mosto de malta se evaluaron distintas estrategias de fermentación: i) fermentación individual (dirigida por un único microorganismo); ii) fermentación secuencial (dirigida por dos o más microorganismos adicionados de forma sucesiva a lo largo del tiempo e fermentación), en primer lugar L. lactis y tras 15 de horas de fermentación, inoculación de la levadura M. reukaufii; iii) fermentación secuencial, en primer lugar L. lactis y tras 15 de horas de fermentación, inoculación de la levadura S. cerevisiae seleccionada a partir de la colección de levaduras de la Zaragozana. La evolución de la fermentación se monitorizó mediante el seguimiento del valor de pH, evolución del crecimiento microbiano (recuento microbiano UFC/mL), concentración de etanol (g/L), ácidos orgánicos (ácido acético y ácido láctico; g/L) y consumo de azúcares (glucosa, fructosa, maltosa; g/L).

De acuerdo a las características sensoriales y parámetros físico-químicos de los productos de fermentación, se seleccionó la estrategia de inoculación secuencial y concretamente la dirigida por L. lactis y S. cerevisiae.

Análisis metagenómico

Si bien la microbiología tradicional permite el aislamiento de microorganismos para su posterior identificación de acuerdo a sus características morfológicas, bioquímicas o genéticas, hay que tener en cuenta que gran parte de los microorganismos presentes en un determinado hábitat no pueden recuperarse en agar ni cultivarse en caldos sintéticos de laboratorio empleando las técnicas habituales. Para solventar este problema, ha proliferado en los últimos años el empleo de técnicas de análisis metagenómico como la secuenciación masiva. Esta técnica permite estudiar cualitativa y cuantitativamente una comunidad microbiana al analizar las moléculas de ADN presentes en la muestra sin necesidad de cultivar previamente los microorganismos. La Figura 1 muestras los resultados de secuenciación masiva a nivel de género (bacteriano) para la muestra flores/fruto de Ramonda myconi, a partir de la cual se aisló el microorganismo seleccionado como inóculo para la fabricación de la cerveza Monte Perdido.

Tal y como se puede observar en este gráfico, además de los microorganismos seleccionados por su potencial aplicación industrial a través de las técnicas de microbiología tradicionales (BAL y levaduras), en las muestras recogidas en el Parque Nacional de Ordesa y Monte Perdido están presentes multitud de microorganismos cuyo conocimiento abre las puertas a su posible aplicación a la industria agroalimentaria como inóculos de microorganismos productores de enzimas o de compuestos funcionales.

Conclusión final

La combinación de una bacteria láctica “salvaje” L. lactis (Figura 2) aislada a partir de una planta propia de roquedos pirenaicos desde el terciario (R. myconi) y de una levadura de la especie S. cerevisae, fue la combinación de inóculos microbianos seleccionada finalmente por la empresa La Zaragozana para rendir su particular homenaje en forma de cerveza, a la cordillera ubicada en la comarca del Sobrarbe, Patrimonio de la Humanidad, y que en 2018 celebró su cien aniversario como Parque Nacional.

Yolanda Gil Ramírez (CNTA), Antonio Fumanal Sopena (AMBAR) y Raquel Virto Resano (CNTA)