Producción de cervezas artesanales con levaduras Saccharomyces y no-Saccharomyces

El sector cervecero es un mercado en auge y, en particular, el segmento de las cervezas artesanales ha experimentado un crecimiento exponencial en Europa, como muestra la última publicación del informe de Europe Economics en 2020. Cabe destacar que el gran volumen de producción de cerveza europea va acompañado de una amplia gama de variedades, debido la riqueza y las tradiciones que presenta la cultura cervecera en cada país. Esta diversidad genera un valor adicional para los consumidores, que demandan nuevas cervezas tales como aquellas mezcladas con zumos de frutas (radlers) o con bajo o nulo contenido alcohólico. De hecho, el consumo de cervezas artesanales se ha incrementado gracias a la disposición por parte del consumidor a pagar mayores precios por un producto de alto valor. Para contribuir al crecimiento económico de este mercado, la innovación se debe convertir en parte del proceso de elaboración de cerveza. La utilización de maltas especiales, adjuntos (azúcares fermentables), lúpulos característicos o incluso la calidad del agua son recursos fundamentales a la hora de formular cervezas nuevas. No obstante, una de las estrategias más interesantes es la utilización de nuevas especies de levaduras, pertenecientes al género no-Saccharomyces, capaces de generar metabolitos deseables en las cervezas y con impacto positivo en su perfil sensorial (Callejo, González y Morata, 2017; Callejo et al., 2019), además la diversidad en el poder fermentativo facilita la producción de cervezas con ausencia o bajo contenido de alcohol, todo ello gracias a la biotecnología.

Mientras que en el 99% de la cerveza mundialmente producida se utilizan levaduras del género Saccharomyces spp. como único inóculo aislado, tanto para la producción de cervezas de tipo ale (fermentación alta, 15-20 °C) o de tipo lager (fermentación baja, 8-14 °C) el empleo de levaduras de géneros no-Saccharomyces ha estado tradicionalmente ligada a las fermentaciones espontáneas. Como resultado destacan cervezas especiales de estilo belga (Lambic, Gueze y Rodenbach) o sucesoras de tipo americano (American coolship ales).

La utilización de levaduras no-Saccharomyces en el proceso de elaboración de cerveza artesanal se puede realizar durante la fermentación principal o durante un proceso posterior conocido como acondicionamiento, guarda o envejecimiento en botella. Este último, permite aumentar la complejidad sensorial de la cerveza obteniendo nuevos y distintivos productos finales. En la elaboración de cerveza, la fermentación principal se va a realizar tras la inoculación de levaduras en un tanque de fermentación, en el cual los azúcares se van a convertir en etanol. Una vez completada esta fase, y habiendo realizado una primera clarificación de la llamada cerveza verde, se puede acometer una segunda inoculación de levaduras en la botella durante el proceso de embotellado. De este modo, se va a efectuar la re-fermentación de la bebida para formar la espuma, desarrollar la carbonatación, realizar la clarificación y sedimentación de las levaduras y, por último, favorecer la maduración aromática y la estabilización coloidal que, en consecuencia, modifican el perfil sensorial de la bebida alcohólica (Callejo, González y Morata, 2017; Larroque et al., 2020).

Materiales y métodos

El objetivo es modular el perfil sensorial de cervezas artesanales gracias a la biotecnología, es decir, utilizando especies de levaduras no- Saccharomyces. Este proyecto pretender dar continuidad a la línea de trabajo iniciada en el Departamento de Química y Tecnología de los Alimentos de la Escuela Técnica Superior de Ingeniería Agrónomos, Alimentaria y de Biosistemas (Etsiaab) de la Universidad Politécnica de Madrid (UPM). Los microorganismos utilizados en esta ocasión fueron Saccharomyces cerevisiae (Sc7VA), Lachancea thermotolerans (L3.1), Hanseniaspora vineae (Hv) y Schizosaccharomyces pombe 938 (Sp938). A partir de un mosto de cerveza realizado en la planta piloto del laboratorio (olla eléctrica Brewferm®, Brouwland), malta de tipo Pilsen y lúpulo en pellet de la variedad Nugget, se diseñaron los siguientes experimentos que fueron llevados a cabo en paralelo (Figura 1).

En el experimento A se realizó una fermentación principal en fermentador (13 L, Ss Brewing Technologies, EEUU) a ~20 °C durante 7 días, siendo inoculado con un cultivo puro de S. cerevisiae, mientras que en el experimento B, realizado en las mismas condiciones, se efectuó la fermentación con un cultivo puro de L. thermotolerans (Figura 2). Tras finalizar la fermentación principal, y clarificar el mosto en frío, se embotelló la cerveza verde en botellas de 25 cl. Antes de concluir el embotellado se inoculó cada una de las muestras con un cultivo puro de S. cerevisiae, L. thermotolerans, H. vineae o S. pombe 938, y se añadió una pequeña proporción de antocianos procedentes del hollejo de la uva como colorante natural, para aportar color, y de azúcares simples (D-glucosa), para favorecer el inicio de la fermentación en botella (Figura 3). Por lo tanto, la segunda fermentación fue realizada de forma secuencial, ya que existe una separación espacio-temporal respecto a las levaduras utilizadas en la primera fermentación. La guarda en botellas se realizó a 20 °C y se mantuvieron durante un tiempo máximo de 8 semanas. Con este diseño experimental se obtuvieron 8 combinaciones (Sc7VA →Sc7VA, Sc7VA → L3.1, Sc7VA → Hv, Sc7VA → Sp938, L3.1 → Sc7VA, L3.1 → L3.1, L3.1 → Hv, L3.1 → Sp938).

Para evaluar la influencia del tiempo de guarda sobre la calidad sensorial de la cerveza, los análisis se realizaron en dos momentos diferentes: a las 4 y a las 8 semanas de acondicionamiento en botella. Los parámetros determinados instrumentalmente y los equipos utilizados fueron  los siguientes: pH con pHmétro (Crison micropH 2000, HACH LANGE); concentración de etanol (v/v %)  y glicerol (g/L) con HPLC-RID (1100 HPLC chromatograph, Agilent Technologies); antocianos de uva con HPLC-DAD (1100 HPLC chromatograph, Agilent Technologies) y absorbancia de los mismos con espectrofotómetro UV-visible (Agilent 8453 spectrophotometer, Agilent Technologies S. L.); compuestos volátiles con GC-FID (Agilent Technologies 6850, Hewlett-Packard); concentración de ácido láctico (g/L) y de glucosa/fructosa (g/L) con multianalizador enzimático (Y25 Biosystems, Biosystems). Para el análisis sensorial, se contó con un panel de catadores entrenados siguiendo las normas ISO 6564: 1985 y ISO 4121:2003. Posteriormente, a las 8 semanas de guarda en botella, se realizó nuevamente el análisis instrumental y sensorial.

Resultados y discusión

El resultado más relevante obtenido en la fermentación principal fueron las diferencias de pH en la cerveza verde para los experimentos A y B (Figura 1). A partir del mismo mosto de malta con un pH inicial de 5,81, el pH del de la cerveza verde fermentada con S. cerevisiae fue 4,41; mientras que en el caso de L. thermotolerans el pH final fue de 3,41. El resultado obtenido con la levadura no- Saccharomyces demuestra la posibilidad de hacer una acidificación libre de bacterias, cuya aplicación en esta fase del proceso se conoce como “ primary souring” (Osburn et al., 2018) y es interesante para la producción de cervezas de estilo sour. Las diferencias de pH observadas se deben a la producción diferencial de ácido L-láctico por parte L. thermotolerans, alcanzando hasta 3,98 g/L de este metabolito, mientras que fue cero para S. cerevisiae. Sin embargo, no se encuentran diferencias tanto en el grado alcohólico (5,35-5,45 v/v % etanol) como en la concentración de glicerol (1,30-1,50 g/L), siendo similar en ambos fermentadores. El metabolito de glicerol se produce como consecuencia del estrés celular cuando la concentración de etanol comienza a incrementarse en el medio. Por lo tanto, se esperaría encontrar una concentración superior de este metabolito cuanto mayor sea el grado alcohólico que presente la cerveza.  En cuanto a la composición de compuestos volátiles determinada por GC-FID y cuantificados gracias a unos patrones internos, sí que se encontraron diferencias en dos de los metabolitos producidos: acetaldehído y acetato de 2-feniletilo. En el caso de S. cerevisiae (experimento A), la concentración de acetaldehído determinada es 4 veces mayor que en L. thermotolerans. Este compuesto se asocia con el descriptor de manzana verde y es un producto directo de la fermentación alcohólica en condiciones anaerobias (transformación de azúcares en ácido pirúvico, descarboxilación en acetaldehído y reducción en etanol). En cambio, en L. thermotolerans (experimento B) parece que los niveles de acetaldehído son reducidos a favor de aumentar la concentración de alcoholes superiores (1-propanol, 1-butanol, 2-butanol, isobutanol, 2-metil-1-butanol, 3-metil-1-butanol y alcohol 3-feniletílico) (Balikci et al., 2016).

 

En la fermentación secundaria, conocido como el proceso de guarda, acondicionamiento o envejecimiento en botella, se realizó la fermentación ambas cervezas verdes con cada una de las levaduras mencionadas anteriormente (S. cerevisiae, L. thermotolerans, H. vineae y S. pombe 938). Los análisis instrumental y sensorial realizados a las 4 y 8 semanas revelaron los siguientes resultados. Destaca el incremento del grado alcohólico en casi todas las fermentaciones. En particular, las muestras re-fermentadas con S. pombe 938 (Sc7VA → Sp938; L3.1 → Sp938)   llegaron a alcanzar hasta 8,50 y 8,88 v/v % etanol. Esta levadura se caracteriza por tener un poder fermentativo muy alto (10-15 % v/v de etanol). En todos los casos, el incremento de etanol se explica por la fermentación azúcares complejos procedentes de la malta (maltosa, maltotriosa), tras el consumo de aquellos más simples como la glucosa. Con el aumento en el grado alcohólico, la concentración de glicerol se incrementó de forma general, pero no se observó una relación proporcional en las cervezas con S. pombe 938. En cuanto a los compuestos volátiles, lo más destacado es la producción de acetato de 2-feniletilo, cuyo descriptor asociado es pétalos de rosas, en la cerveza fermentada primariamente con L. thermotolerans y secundariamente con H. vineae (L3.1 → Hv). Mientras que el pH no experimentó notables cambios a pesar de que dos muestras contenían L. thermotolerans para la re-fermentación en botella, sí que se observaron diferencias a nivel sensorial derivadas del pH ácido de partida. La acidez de las cervezas que fueron fermentadas principalmente con L. thermotolerans se hizo perceptible tanto en el color como en la acidez en boca. Como se explica anteriormente, el color de la cerveza fue modificado al añadir antocianos procedentes del hollejo de la uva, que es la molécula responsable del color en vinos tintos. Esta molécula a pH ácidos muestra un equilibrio entre las diferentes formas químicas que se desplazada en favor del catión flavilio que es de color rojo (absorbancia a 520 nm). De este modo, se observó que las cervezas fermentadas principalmente con L. thermotolerans, al presentar un pH inferior, tenían un color rojizo más intenso, que se mantuvo a lo largo de la guarda en botella. En comparación, las cervezas obtenidas mediante el empleo de S. cerevisiae en la fermentación principal (experimento A) el color se transformó en un tono ámbar durante el acondicionamiento en botella (Figura 4). A nivel gustativo, las cervezas fermentadas con L. thermotolerans en la fermentación principal (experimento B), también presentaron una acidez notable que se mantuvo a la largo de la fermentación en botella, si bien al re-fermentar con levaduras diferentes otras percepciones y características afloraron, teniendo todas ellas gustos diferentes. Por último, cabe mencionar que a pesar de que la cantidad de compuestos volátiles disminuyó a lo largo del acondicionamiento en botella, las cervezas mostraron unos perfiles sensoriales mejor integrados tras las 8 semanas, que puede estar relacionado con el aumento de la calidad aromática para todas las muestras.

Referencias

-Europe Economics (2020). The Contribution made by Beer to the European Economy. EU Report -March 2020.

-Callejo MJ, González C, Morata A (2017) Use of non-Saccharomyces yeasts in bottle fermentation of aged beers. In Brewing Technology. InTech.

-Callejo MJ,García Navas JJ, Alba R, Escott C, Loira I, González MC, Morata A(2019)Wort fermentation and beer conditioning with selected non-Saccharomyces yeasts in craft beers. Eur Food Res Technol, 245, 1229–1238 doi:10.1007/s00217-019-03244-w

-Larroque MN, Carrau F, Fariña L, Boido E, Dellacassa E, Medina K (2021). Effect of Saccharomyces and non-Saccharomyces native yeasts on beer aroma compounds. Int J Food Microbiol, 16,337:108953. doi: 10.1016/j.ijfoodmicro.2020.108953.

-Osburn K, Amaral J, Metcalf SR, Nickens DM, Rogers CM, Sausen C, Caputo R, Miller J, Li H, Tennessen JM, Bochman ML (2018). Primary souring: A novel bacteria-free method for sour beer production. Food Microbiol, 70,76-84. doi: 10.1016/j.fm.2017.09.007.

-Balikci EK, Tanguler H, Jolly NP, Erten H (2016). Influence of Lachancea thermotolerans on cv. Emir wine fermentation. Yeast, 33, 313-321.