Aislamiento de levaduras autóctonas con potencial para la elaboración de cervezas especiales diferenciadas

Las bebidas fermentadas han sido y son elementos clave en la gastronomía y la cultura de España. Nuestro país produjo casi 4.000 millones de litros de cerveza en el año 2019, siendo la cuarta potencia productora de la Unión Europea (solo detrás de Alemania, Reino Unido y Polonia) y la undécima del mundo. En torno al 1% de esta producción se corresponde con cerveza elaborada de forma artesanal y, aunque pueda parecer un porcentaje poco significativo, el auge de esta filosofía de elaboración se manifiesta con los datos de crecimiento de producción en la última década (de menos de 2 millones de litros en 2010 a 40 millones anuales) y del incremento de microcervecerías registradas (de unas 70 en 2010 a más de 500 en la actualidad) (Notas 1-3). Entre esas fábricas cerveceras, 22 de ellas operan actualmente en el País Vasco, que ya en 2018 produjeron 1,25 millones de litros (un 30% más que en 2017), consumiéndose en Euskadi el 54% de su producción y exportándose el 19% fuera de España. Los informes registran hasta 292 variedades diferentes de cerveza artesanal vasca, lo cual es un signo evidente de la creatividad y capacidad de diferenciación del producto (Nota 4).

Estos rasgos identificativos pueden deberse a su método de elaboración y a los ingredientes empleados (diferentes cereales, frutas…), pero también a las principales protagonistas del proceso fermentativo: las levaduras. Durante décadas se ha estudiado su importancia para dar lugar a bebidas con unos u otros rasgos. Así, se han establecido una clasificación de estos microrganismos como levaduras de alta o baja fermentación, que darían lugar a cervezas tipo ale o lager, y que operarían a temperatura templada (18-24 ^oC) o baja (7-12 ^oC), respectivamente.

En todos los casos, las levaduras más ampliamente utilizadas en la industria cervecera se enmarcan dentro del género Saccharomyces, destacando S. cerevisiae y S. pastorianus. No obstante, ante ese afán diferenciador y esa búsqueda de innovación, el foco se va ampliando a otras levaduras “no-Saccharomyces” que pueden presentar características tecnológicas muy interesantes y dar lugar a cualidades organolépticas novedosas, como determinadas especies del género Pichia, Wickerhamomyces o Kluyveromyces⁵.

En este trabajo, se han aislado levaduras propias de ingredientes habituales utilizados en cerveceras artesanales de Bizkaia, incluyendo trigo, centeno, avena, maltas de diferente naturaleza y lúpulos. Los aislamientos se realizaron mediante técnicas microbiológicas clásicas en diferentes condiciones y posteriormente, se identificaron las especies de levaduras aisladas mediante técnicas genómicas (PCR y secuenciación de una fracción del ADN fúngico).

Levaduras autóctonas identificadas y sus aplicaciones

Los experimentos llevados a cabo se centraron en identificar la gran variedad de microorganismos presentes en la superficie de las muestras, pero también en aislar aquellos microorganismos predominantes tras un proceso simulado de fermentación espontánea (fermentación con los microorganismos propios de las muestras), en un caldo de extracto de malta, con la finalidad de aislar las levaduras con mayor capacidad o fuerza de fermentación. Otro parámetro de caracterización que se incluyó para ampliar el abanico de especies diferentes aisladas, fue la temperatura. Así, se aislaron levaduras a dos temperaturas diferentes (15 ^oC y 25 ^oC) para dar respuesta a los dos principales tipos de cervezas según el tipo de fermentación (ale o lager).

Tras este trabajo de aislamiento (Figura 1), los análisis del crecimiento microbiológico y morfología de colonias y células (Figura 2) y el análisis de las secuencias genómicas, se obtuvo una colección de 518 cepas de levaduras en total, en la que se pudo observar una amplia diversidad de especies.

Como se ha comentado con anterioridad, podría esperarse que muchas de estas cepas se correspondiesen con la especie Saccharomyces cerevisiae, tradicionalmente relacionada con la fermentación de la cerveza (y otras bebidas y alimentos). Sin embargo, entre todas las levaduras aisladas en este trabajo, solamente se encontraron dos cepas, entre esas 518 secuenciadas e identificadas, cuya secuencia genómica se correspondiera con esta especie. Esto se explica porque S. cerevisiae es una levadura que no tiene tanta capacidad de proliferación en cereales (se analizaron muestras de trigo, centeno, avena), y sí en frutas como la uva, donde tiene más fácil acceso a los azúcares que va a utilizar (Nota 6).

Por el contrario, en este caso, el mayor número de cepas correspondieron a levaduras de las especies Pichia fermentans (114 cepas), Pichia kudriavzevii (84 cepas), Wickerhamomyces anomalus (34 cepas) y Cystofilobasidium macerans (30 cepas). A pesar de ser especies mucho menos conocidas, estos microorganismos muestran un gran potencial para la diferenciación y personalización del producto final.

Las levaduras de la especie Pichia fermentans se encontraron presentes en casi todas las muestras de cereales analizadas, y fueron especialmente frecuentes en aquellas en las que se simuló una fermentación a distintos tiempos y temperaturas. Esta levadura ya es conocida por su potencial en el campo de la cervecería, pues tiene especial importancia en la elaboración de cervezas de fermentación espontánea. Sin embargo, la obtención de cultivos puros y su caracterización completa permitirá un mejor control del proceso de fermentación, lejos de la incertidumbre de un proceso espontáneo. Independientemente de su utilización en cervecería, esta especie puede ser también utilizada para la producción de enzimas (lipasas, proteasas, glucosidasas, etc.) en otros sectores (Notas 5, 7, 8).

 

La segunda especie más frecuentemente identificada también pertenece al género Pichia: se trata de cepas de Pichia kudriavzevii, teleomorfo de Candida krusei. La mayoría de estas cepas fueron más selectivas en cuanto a su matriz de aislamiento, siendo aisladas solo en algunas muestras de trigo y en una variedad de malta. Este microorganismo es utilizado industrialmente en la producción de glicerol y succinato. Sin embargo, esta levadura también posee efectos destacables en la obtención de nuevos aromas en vinos, lo que la sitúa como un interesante candidato en la búsqueda de matices innovadores en otros productos fermentados, como la cerveza (Notas 9, 10).

Otra levadura “no-Saccharomyces” identificada en nuestras muestras, con un gran interés para la industria de las bebidas fermentadas, es Wickerhamomyces anomalus (antiguamente clasificado también dentro del género Pichia, con el nombre de Pichia anomala), cuya presencia se hizo evidente sobre todo en trigo y maltas a partir del sexto día de fermentación. Este microorganismo fue considerado hace tiempo una especie no deseada en la fermentación espontánea del vino. Sin embargo, en la actualidad, gracias a los estudios de sus propiedades, la visión es completamente diferente, siendo mucho más valorada debido a sus adecuadas características fisiológicas (convenientemente seleccionadas). Por ello, se ha comprobado que su aplicación en cultivos mixtos con S. cerevisiae mejora la complejidad y el aroma del vino y otras bebidas como el Apfelwein (del alemán: vino de manzana, una bebida de la familia de la sidra), y que también es útil para la producción de enzimas y metabolitos con interés enológico (como la β-D-glucosidasa, α-L-arabinofuranosidasa y la β-D-xilosidasa, implicadas en la liberación de compuestos aromáticos) (Notas 11, 12).

La última de las especies con un elevado número de cepas identificadas fue Cystofilobasidium macerans, una levadura que creció particularmente bien en aquellos aislados desde muestras de avena y algunas maltas. Sin aplicación conocida en la industria cervecera hasta la fecha, esta especie forma parte de las llamadas “levaduras rojas” (junto con los géneros Rhodotorula o Sporobolomyces) por su gran capacidad para sintetizar y/o acumular carotenos (pigmentos naturales que aportan coloraciones amarillas, naranjas o rojas a ciertos alimentos) y también pueden tener un gran interés en la producción de lipasas, biosurfactantes y lípidos y otros compuestos de alto valor añadido a partir de diferentes matrices alimentarias y agrícolas (Nota 13).

Finalmente, aunque con mucha menor frecuencia que las especies ya citadas, cabe destacar la identificación de otras cepas concretas dentro algunas especies microbianas a las que también se les relacionan diferentes utilidades. Es el caso, por ejemplo, de levaduras del género Rhodotorula, como R. glutinis, productora de enzimas/proteínas, carotenoides/pigmentos y metabolitos de interés para la industria alimentaria y que presenta una alta capacidad antimicrobiana (eficiente en el control microbiológico de frutas) (Nota 14) , R. dairenensis, con capacidad de eliminación de contaminantes (hidrocarburos) (Nota 15)  y R. katrochvilovae, antagonista de algunos fitopatógenos como Botrytis cinerea (Nota 16) . También se aislaron unas pocas especies del género Sporobolomyces, en concreto, Sporobolomyces roseus, productor de carotenoides y enzimas con alta actividad a bajas temperaturas (Notas 17, 18) y Sporobolomyces ruberrimus, productor de carotenoides antioxidantes y antimicrobianos como la torullarodina (Notas 19, 20).

A la vista de estos resultados, queda patente la riqueza de la microbiota de las muestras de cereales analizados, muy probablemente extrapolable a cualquier materia prima autóctona, y su gran potencial para disponer de cultivos propios que permitan su puesta en valor y su aprovechamiento para diferentes finalidades, como las citadas en este estudio.  Tras la identificación de las mencionadas especies potencialmente utilizables para la industria cervecera, queda por delante un gran trabajo de caracterización tecnológica y de seguridad para llegar a vislumbrar las verdaderamente aprovechables en la fermentación de la malta u otros ingredientes (por rapidez de fermentación, temperatura óptima, actividad enzimática, no formación de compuestos indeseados como aminas biógenas, etc.), y poder estudiar su influencia en el producto final.

Conclusión

En este estudio de aislamiento e identificación de levaduras para cervecería, ha quedado demostrada la gran diversidad de cepas presentes en los diferentes ingredientes, observándose también variaciones en función de la temperatura y el tiempo de incubación/fermentación, lo que da una idea del gran trabajo de obtención de levaduras propias autóctonas no convencionales y posterior personalización del producto que puede realizarse en cualquier cervecería con este punto de partida.

Entre las especies identificadas, muchas de ellas son clasificadas como levaduras de gran potencial e interés para la industria cervecera, con aplicaciones previas ya estudiadas en campos como la enología, la producción de compuestos bioactivos con propiedades saludables y el diseño de nuevos alimentos y bebidas, destacando P. fermentans, P. kudriavzevii y W. anomalus, que pueden ser una alternativa o complemento a la utilización de cepas de S. cerevisiae, permitiendo la individualización del producto final, para dar lugar a una cerveza diferenciada con características propias.

Notas

1: Cerveceros de España, Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación (2019). Informe Socioeconómico del sector de la cerveza en España 2019. Catálogo de Publicaciones de la Administración General del Estado. http://publicacionesoficiales.boe.es/

2: Barth Hass Group (2019). The Barth Report 2018-2019.

3: The Brewers of Europe (2018). Beer Statistics 2018 Edition.

4: Beer Events SL, Euskal Garagardo Elkartea, Gobierno Vasco (2018). Estado de la cerveza artesana en Euskadi 2018.

5: Bourdichon y col. (2012). Review: Food fermentations: Microorganisms with technological beneficial use. International Journal of Food Microbiology 154 (2012) 87–97.

6: Goddard, MR., Greig, D. (2015). Saccharomyces cerevisiae: a nomadic yeast with no niche? FEMS Yeast Research, 15, fov009.

7: Bokulich, NA, Bamforth, CW, Mills, DA (2012). Brewhouse-resident microbiota are responsible for multi-stage fermentation of American Coolship Ale. PLoS ONE, 7, e35507.

8: Zaky, AS, Tucker, GA, Daw, ZY, Du, C (2014). Marine yeast isolation and industrial application. FEMS Yeast Research, 14, 813-825.

9: Shi, WK, Wang, J, Chen, FS, Zhang, XY (2019). Effect of Issatchenkia terricola and Pichia kudriavzevii on wine flavour and quality through simultaneous and sequential co-fermentation with Saccharomyces cerevisiae. LWT – Food Science & Technology, 116, 108477.

10: Douglas, AP, Offei, B, Braun-Galleani, S, Coughlan, AY, Martos, AAR, Ortiz-Merino, RA, Byrne, KP, Wolfe, KH (2018). Population genomics shows no distinction between pathogenic Candida krusei and environmental Pichia kudriavzevii: One species, four names. PLoS Pathogens, 19, e1007138.

11: Padilla, B, Gil, V, Manzanares, P (2018). Challenges of the non-conventional yeast Wickerhamomyces anomalus in winemaking. Fermentation, 4, 68.

12: Satora, P, Tarko, T, Sroka, P, Blaszczyk, U (2014). The influence of Wickerhamomyces anomalus killer yeast on the fermentation and chemical composition of apple wines. FEMS Yeast Research, 14, 729-740.

13: Szotkowski, M, Byrtusova, D, Haronikova, A, Vysoka, M, Rapta, M, Shapaval, V, Marova, I (2019). Study of metabolic adaptation of red yeasts to waste animal fat substrate. Microorganism, 7, 578.

14: Hernandez-Almanza, A, Montanez, JC, Aguilar-Gonzalez, MAA, Martinez-Avila, C, Rodriguez-Herrera, R, Aguilar, CN (2014). Rhodotorula glutinis as source of pigments and metabolites for food industry. Food Bioscience, 5, 64-72.

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16: Miccoli, C, Palmieri, D, De Curtis, F, Lima, G, Ianiri, G, Castoria, R (2018). Complete genome sequence of the biocontrol agent yeast Rhodotorula katrochvilovae strain LS11. Microbiology Resource Announcements, 6, e00120-18.

17: Krysiak, J, Bialkowska, A, Turkiewicz, M (2016). Aspartic protease – Unique enzyme from psychrotolerant yeast Sporobolomyces roseus, 33, S109.

18: Davoli, P, Weber, RWS (2002). Carotenoid pigments from the red mirror yeast Sporobolomyces roseus. Mycologist, 16, 102-108.

19: Cardoso, LAC, Jackel, S, Karp, SG, Framboisier, X, Chevalot, I, Marc, I (2016). Improvement of Sporobolomyces ruberrimus carotenoids production by the use of raw glycerol. Bioresource Technology, 200, 374-379.

20: Kot, AM, Blazejak, S, Gientka, I, Kieliszek, M, Brys, J (2018). Torulene and torularhodin: “new” fungal carotenoids for industry? Microbial Cell Factories, 17, 49.