Verificación de métodos microbiológicos: aplicación de la nueva norma ISO 16140-3:2021

Es muy frecuente en el ámbito de la implantación y acreditación de métodos microbiológicos indicar que el laboratorio ha ‘validado’ el método, cuando realmente sólo ha demostrado una correcta ejecución del mismo mediante el empleo de un número limitado de matrices. Es importante, por ello, establecer una clara diferencia entre ambos conceptos (Figura 1).

La validación del método consiste en establecer las características de rendimiento del método analítico y demostrar que dichas características cumplen con las especificaciones requeridas para su uso previsto.

Por el contrario, la verificación del método consiste en demostrar que un método validado se ha implementado correctamente en mi laboratorio y es adecuado para el uso previsto que voy a hacer de dicho método (ejemplo: tipo de matrices analizadas); es decir, responder a la pregunta: ¿se ha implementado correctamente un método microbiológico en mi laboratorio?

Características generales para la verificación de métodos microbiológicos

El protocolo técnico de verificación contemplado en la Norma ISO 16140-3:2021 incluye dos etapas diferentes a realizar en todos los casos:

1. Verificación de la implementación para demostrar que el laboratorio tiene competencia para ejecutar el método validado.
2. Verificación de alimentos para demostrar que el laboratorio es capaz de obtener resultados válidos con las categorías de alimentos que se analizan rutinariamente.

Para la realización de la verificación es necesario que e l laboratorio defina y trabaje considerando el alcance de validación del método, así como el alcance de aplicación del método en el laboratorio.

Es por ello necesario que el método alternativo o normalizado a verificar disponga previamente de datos de validación, si bien, para los métodos normalizados no validados, la norma prevé una etapa transitoria hasta 2028.

La verificación de la implementación (etapa 1) implica el análisis de un alimento que ha sido empleado durante la validación (para métodos cualitativos) o al menos que se encuentre dentro del alcance del método y que sean empleado habitualmente por el laboratorio (cuantitativos).

Para la verificación de alimentos (etapa 2) se requiere de un mínimo de cinco alimentos que presenten un potencial reto para el método objeto de verificación y que se deben seleccionar a partir de las diferentes categorías de alimentos analizadas por el laboratorio. El número de categorías puede reducirse si el laboratorio analiza únicamente algunas de ellas, mientras que debe ampliarse en el caso de que, además de alimentos, el laboratorio desee verificar el método para piensos, muestras ambientales y procedentes de producción primaria.

Para seleccionar los alimentos que pueden suponer un reto, deben considerarse las características que supongan el peor escenario debido a un potencial impacto en el rendimiento del método, como por ejemplo:

• Físicas (bajo pH o actividad de agua, alta viscosidad o color).
• Químicas (presencia de inhibidores como enzimas, polifenoles, sal, etc.).
• Flora competitiva (fermentos, probióticos, alterantes).

Verificación de métodos cualitativos (detección)

La verificación de los métodos cualitativos consiste en el análisis de las matrices inoculadas con bajos niveles de microorganismos, al objeto de determinar el Nivel de Detección estimado (eLOD₅₀) y compararlo con el Nivel de Detección (LOD₅₀) de la validación del método.

El número de replicados necesarios para cada alimento a verificar depende del protocolo que seleccione el laboratorio (ver Tabla 1).

La elección del protocolo depende de la habilidad del laboratorio para alcanzar el nivel de inoculación deseado. Generalmente se recomienda emplear el protocolo 3 cuando se trabaja con material de referencia certificado de concentración conocida y el protocolo 1 cuando se desconoce exactamente la concentración inoculada. El protocolo 2 se suele emplear cuando el primer protocolo seleccionado no alcanzó los niveles de inóculo deseados y debe ser repetido.

A modo de ejemplo (ver Figura 2), si se selecciona el protocolo 3, el protocolo a realizar para la verificación del método de Salmonella spp (ISO 6579-1:2017) sería:

Para la verificación de la implementación, se ha seleccionado cuajada fresca de leche dado que este producto está incluido en la validación de la norma. El protocolo indicado en la imagen debe repetirse un total de siete veces para la matriz.

Para la verificación de alimentos, se realizar el mismo protocolo indicado sobre al menos cinco alimentos de diferentes categorías que analice el laboratorio de forma rutinaria y que supongan el ‘peor escenario’, repitiendo el protocolo de nuevo siete réplicas por matriz.

Para cada matriz, es necesario realizar la confirmación de al menos una réplica.

El método se considera validado si para cada matriz, se obtienen al menos seis resultados positivos de las siete réplicas inoculadas con 3-5 ufc.

El empleo de los protocolos 1 o 2 indicados en la Tabla 1, requiere del uso de tablas estadísticas disponibles en la norma ISO 16140-3 para la estimación del eLOD50, de manera que el método se considera verificado si el eLOD50 ≤ 4 x LOD50 obtenido durante el estudio de validación. En caso de no disponer del LOD50 del método empleado, dado que el alimento seleccionado por el laboratorio no ha sido contemplado en el estudio de validación, o bien porque el método de referencia no ha sido validado, el LOD50 se reemplaza por el valor teórico de 1 ufc/muestra.

Verificación de métodos cuantitativos

El protocolo de verificación de métodos cuantitativos, al contrario que en el caso anterior, requiere de dos protocolos diferenciados para las dos etapas a considerar

Verificación de la implementación del método:

Consiste en determinar la desviación estándar de reproducibilidad intralaboratorio (S_IR) mediante el análisis duplicado de un alimento en condiciones de reproducibilidad (ver Figura 3). Dichos duplicados deben repetirse al menos en 10 ocasiones.

A partir de los diez resultados duplicados (en valor logarítmico) se estima el valor de S_IR:

Los resultados obtenidos para ese alimento se comparan con el valor mínimo de la desviación estándar de reproducibilidad (S_R) obtenido a partir de la validación del método a evaluar.

La verificación de la implementación del método se considera satisfactoria si:

S_IR verificación ≤ 2 x S_R mínima de validación.

Verificación de alimentos:

La verificación de alimentos se realiza mediante la exactitud o, mejor dicho, el sesgo estimado (eSesgo); es decir, la diferencia entre el valor de referencia obtenido sin matriz, y el resultado de los alimentos inoculados con dicho valor de referencia (ver Figura 4).

Para ello se debe contar con cinco alimentos de diferentes categorías. Cada alimento se inocula a tres niveles (acorde a los niveles habitualmente analizados por el laboratorio). Para cada nivel de contaminación se analiza cada alimento empleando un lote diferente en dos porciones (A y B), así como se realiza una porción de análisis sin alimento (referencia).

Para cada nivel de inoculación y alimento se estima el sesgo como la diferencia entre el valor medio de las porciones A y B (con alimento) y el valor de referencia (sin alimento).

El método se considera verificado si, para cada caso:

eSesgo = valor medio – valor referencia < |0.5 (Log₁₀ cfu/g-mL)|.

¿Cuándo debo verificar el método?

La verificación de métodos empleando el protocolo reflejado en la ISO 16140-3 no es necesaria si el método ya se ha verificado previamente (ejemplo: métodos ya acreditados o implementados en el laboratorio).

La verificación deberá realizarse cuando:

• Se implementa un nuevo método en el laboratorio.
• Cuando un método ya implementado sufre modificaciones relevantes que se consideran mayores afectando al rendimiento del método y que generalmente requieren también de una revalidación (generalmente asociados a cambios en los medios de cultivo, condiciones de incubación, etc.).
• Cuando el laboratorio amplíe su alcance originalmente contemplado en el método. Dicho alcance debe, en cualquier caso, encontrarse contemplado originalmente en el método.

De forma complementaria a la publicación de la norma, se ha publicado un documento de transición al objeto de facilitar la verificación de los métodos de referencia que todavía no disponen de datos de validación publicados.

Dicho período de transición es válido hasta finales de 2027 y los protocolos a seguir en los casos que aplique vienen reflejados en el Anexo F de la nueva norma.  Básicamente se indica en dicho anexo que, en el caso en que el método de referencia no esté validado, no se debe realizar la primera etapa de verificación de la implementación, realizando únicamente los ensayos requeridos para la verificación de matrices.

La verificación de métodos permite al laboratorio disponer de datos objetivos para demostrar la correcta implantación del mismo en sus condiciones particulares y asegurar la adecuación al uso previsto.

Los parámetros a considerar, número de replicas y evaluación de resultados se puede encontrar resumidos en la Tabla 2.

Debe considerarse que el procedimiento de validación es complejo y requiere de un proceso largo y costoso, por lo que únicamente métodos de referencia o métodos alternativos validados pueden ser verificados por el laboratorio usuario.