Detección de la actividad proteolítica: una oportunidad para el control de la vida útil de las leches UHT destinadas a exportación

La composición nutricional, la actividad de agua elevada y el pH neutro de la leche cruda la convierten en un caldo de cultivo perfecto para la proliferación de microorganismos patógenos (Listeria, Salmonella, E. coli, Campylobacter y algunos hongos) y alterantes (Pseudomonas, Clostridium, Bacillus). Por ello, las condiciones de conservación de la leche cruda están reguladas por el Real Decreto 1679/1994, en el que se indica un tratamiento térmico de la leche cruda para eliminar los microorganismos patógenos y alterantes y asegurar un consumo seguro. 

Con la implantación de este marco regulatorio, la leche cruda comenzó a almacenarse y transportarse a temperaturas de refrigeración (≤6 °C) hasta recibir el tratamiento térmico correspondiente. Sin embargo, la aplicación de esta medida no frenaba totalmente la alteración microbiana, puesto que hay microorganimos capaces de crecer a temperaturas entre 0-10 °C. En concreto, hablamos de los psicrótrofos y psicrófilos. A este grupo microbiano pertenecen especies comúnmente encontradas en la leche cruda: Serratia spp., Pseudomonas spp. o especies del género Bacillus.

Muchas especies de microorganismos psicrótrofos producen enzimas proteolíticas extracelulares termorresistentes cuando la leche se almacena en refrigeración. Estas enzimas actúan frente a la β- y la Κ-caseína de la leche, degradando las micelas de caseína y liberando componentes solubles como polipéptidos y aminoácidos, que afectan a la calidad y al rendimiento del producto (Vaghela et al., 2017). Tras el tratamiento UHT, los microorganismos psicrótrofos son eliminados, pero las enzimas termorresistentes producidas soportan las altas temperaturas del tratamiento térmico. 

Si la leche está destinada a la exportación, especialmente a destinos en los que las temperaturas son más altas que en nuestro país, las empresas lácteas nacionales se encuentran con un problema: cuando la temperatura ambiente es cercana a la temperatura óptima de actividad de esas enzimas (40-50 °C), la vida útil de la leche se acorta considerablemente, ya que sus propiedades organolépticas se ven afectadas (sabor amargo, olor agrio, presencia de sedimento, coagulación, etc.). Esto genera grandes pérdidas económicas y dificulta la expansión al mercado internacional.

¿Cómo atajar un problema que no se da en la distribución al mercado nacional pero que compromete seriamente la exportación? Conocer la concentración de enzimas proteasas (o la actividad enzimática) en la leche UHT tras el tratamiento térmico permitiría a los productores tomar decisiones sobre el destino de su producto y optimizar el proceso de fabricación, desde el ordeño hasta el tratamiento térmico, de sus leches UHT. 

Por tanto, disponer de métodos que permitan detectar la actividad proteolítica ejercida por las proteasas microbianas, o cuantificar su concentración en leches UHT, se hace, hoy más que nunca, muy necesario. Para suplir esta necesidad del sector lácteo, CNTA, en colaboración con la empresa Calidad Pascual, ha liderado un estudio (proyecto Histamilk- convocatoria Retos Colaboración 2018-2022) en el que se ha cuantificado la actividad proteolítica de distintos tipos de leches mediante diversos métodos.

Métodos indirectos y directos descartados

En primer lugar, se utilizó el método agar-caseinato, que implica la siembra de leches crudas/pasteurizadas en un agar de recuperación que contiene caseína en su composición. Si la leche contiene microorganismos productores de proteasas, éstos degradarán la caseína durante la incubación de las placas y se formará un halo (Figura 1) alrededor de las colonias microbianas.

Este método es útil para la detección de microorganismos con actividad proteasa, pero no es válido para leches UHT (los microorganimos han sido eliminados). Además, no es un método rápido y es semicuantitativo, pero no cuantifica las proteasas.

Otro de los métodos testados fue el OPA (O-Ftaldialdehído). Este método indirecto cuantifica los aminoácidos liberados por acción de las proteasas mediante la reacción de los grupos α-amino con el reactivo OPA. En este caso, no se detectó actividad (Figura 2) en ninguna de las leches testadas (barras verdes). Sin embargo, tras incubar dichas leches durante 72 horas a 25 °C (barras de puntos), la concentración de equivalentes de leucina aumentó hasta valores detectables en aquellas leches que contenían proteasas microbianas. Aunque este método parecía prometedor, la cuantificación de equivalentes de leucina en leches UHT siempre estaba por debajo del límite de detección de la técnica, por lo que fue descartado.

Se testaron también dos métodos directos, que cuantificaban directamente la actividad enzimática, pero que también fueron finalmente descartados.

Por un lado, se utilizó la técnica de la azocaseína, compuesto que lleva unido un cromóforo. Todas las leches testadas mostraron valores de actividad proteolítica inferiores al límite de detección de la técnica.

En el caso del otro método directo, las AK-Tablets, se utiliza como sustrato caseína unida mediante enlaces cruzados a la azurina, un componente de color azul insoluble en agua. La hidrólisis por las proteasas produce fragmentos coloreados solubles en agua. La tasa de liberación de estos fragmentos está directamente relacionada con la actividad enzimática. La cuantificación se realiza con una recta patrón que se elabora con distintas concentraciones de la proteasa alcalina bacteriana subtisilina A. La propia matriz de la leche producía mucho “ruido de fondo” en la cuantificación y de ahí que este método también se descartara.

CNTA también probó otros dos métodos basados en la detección de fluorescencia: uno directo (Protease Activity Assay Kit; Abcam) y otro indirecto (fluorescamina). Ambos métodos presentaron un límite de detección superior que la concentración de proteasas de las leches UHT testadas, y también fueron descartados.

Finalmente, CNTA cuantificó los aminoácidos libres generados por las proteasas mediante HPLC de fase reversa. Se calculó la suma de aminoácidos totales para cada tipo de leche (Figura 3) y se observó que el perfil no se modificaba entre leches cruda, pasteurizada y UHT, salvo algún caso concreto con alteraciones en el almacenamiento de la leche cruda. 

Consecuentemente, CNTA consideró el método como adecuado para la cuantificación indirecta de la actividad proteolítica que tiene lugar en leches UHT, y realizó un estudio específico en leches UHT para comprobar si la concentración de aminoácidos libres aumentaba durante 20 meses incubándolas a temperatura ambiente. Se pretendía seleccionar uno o varios aminoácidos como indicadores de actividad proteasa y, en un futuro, poder relacionar la cuantificación de estos aminoácidos con el fin de vida útil de las leches UHT. 

Los resultados fueron prometedores ya que se observaron dos aminoácidos (Figura 4) susceptibles de ser indicadores de actividad proteasa en la leche: el ácido glutámico (fucsia) y la histidina (morado). La concentración de ambos fue aumentando, detectándose hasta 180 ppm tras los 20 meses de almacenamiento.

Este resultado da lugar a la posibilidad de un estudio más amplio en el que se relacionaría matemáticamente la concentración de estos dos aminoácidos en leches UHT (tras el tratamiento térmico) con el fin de vida útil (aparición de alteración organoléptica) de la misma.