Nuevas estrategias para un viejo problema: hinchazón tardía de quesos

Las bacterias formadoras de esporas representan una de las mayores amenazas de deterioro para los productos lácteos, ya que sobreviven a los tratamientos térmicos de la leche y durante la fabricación de productos lácteos forman biopelículas en los equipos de fabricación, contaminan los productos finales perjudicando su calidad, vida útil y aceptabilidad, causando graves pérdidas económicas, y pueden dañar la reputación de las empresas implicadas.

Clostridium es un género de bacterias anaerobias, formadoras de esporas termorresistentes que persisten durante la cadena de producción de queso. La pasterización puede incluso activar la germinación de las esporas de Clostridium, que comienzan entonces su fase activa de crecimiento y multiplicación en el queso, también a temperaturas de maduración. Una vez que han germinado, las células vegetativas de Clostridium producen ácido butírico, ácido acético, CO₂ e H₂ a partir del ácido láctico presente en el queso, dando lugar a quesos con sabor y olor rancio y desagradable y con la pasta digerida, suelta, con rajas y cavernas, pudiendo romperse la corteza por la presión del gas formado (Garde et al., 2013). Este problema, conocido como hinchazón tardía o butírica, aparece en los quesos duros y semiduros tras días, semanas o meses en la cámara de maduración, e incluso en los puntos de venta. La principal especie implicada es Clostridium tyrobutyricum, y también hay otros Clostridium spp. relacionados.

Aunque la hinchazón tardía es un problema muy conocido, es difícil acabar con ella ya que las esporas de Clostridium están ampliamente distribuidas en el medioambiente, son muy resistentes, y un bajo número en la leche puede causar el defecto si las condiciones en el queso son adecuadas para su germinación y crecimiento. Actualmente, para el control de Clostridium alterantes en quesos se utilizan métodos físicos como la bactofugación o microfiltración de la leche de fabricación, que reducen el número esporas, o la adición de nitrato y/o lisozima (de huevo) a la leche para inhibir la germinación de Clostridium. Sin embargo, estos aditivos presentan ciertos riesgos sanitarios, ya que el nitrato puede dar lugar a nitrosaminas cancerígenas, y la lisozima a reacciones alérgicas, y generan cierto rechazo en el consumidor actual, que busca alimentos más saludables y naturales. Los métodos físicos requieren equipos específicos, que suponen costes adicionales de funcionamiento, y todo ello se traduce en una inversión de capital que no está al alcance de todas las queserías. Además, ninguno de estos métodos es del todo eficaz, ya que la problemática persiste en el sector. 

Para resolver algunas de las desventajas mencionadas se están estudiando nuevas estrategias transferibles al sector lácteo para prevenir la hinchazón tardía del queso, como el uso de cultivos protectores, altas presiones, bacteriófagos y sus endolisinas o plantas aromáticas, entre otras.

Cultivos protectores iniciadores/adjuntos

Las bacterias lácticas utilizadas en la producción de queso contribuyen a mejorar su higiene y conservación a través de la producción de ácido y distintos compuestos antimicrobianos, como bacteriocinas o reuterina. Su uso ofrece ventajas como una fácil aplicación, sin equipos específicos y/o costosos, uso en cualquier variedad de queso y, en base a una buena selección, puede no afectar a las características sensoriales del queso, o incluso resultar positivo. 

Distintos grupos de investigación hemos estudiado la aplicación de bacterias lácticas productoras de bacteriocinas para controlar el crecimiento de Clostridium en queso (Figura 1.1). Nuestro grupo ha conseguido controlar el crecimiento de Clostridium beijerinckii y prevenir la hinchazón tardía en queso utilizando Lactococcus lactis INIA 415, productor de nisina Z y lacticina 481, como fermento, incluso en condiciones favorables para la germinación y crecimiento de Clostridium (Garde et al., 2011). El empleo de bacterias lácticas productoras de bacteriocinas como nisina Z o lacticina 3147 como adjuntos también se ha ensayado con éxito para evitar la hinchazón tardía del queso (Rilla et al., 2003; Martínez-Cuesta et al., 2010). En otros casos el empleo de productores de bacteriocinas ha conseguido retrasar la aparición del defecto (Bogovic-Matijasic et al., 2007; González y Zárate, 2015; Ávila et al., 2020).

Algunas cepas de Limosilactobacillus reuteri son capaces de producir reuterina (3-hidroxipropanal), un potente antimicrobiano activo frente a microorganismos patógenos y alterantes, a partir de glicerol. Nuestro grupo ha logrado inhibir el crecimiento de C. tyrobutyricum y prevenir la aparición de hinchazón en quesos modelo de vaca y, en quesos semicurados de oveja de 3 kg, utilizando el adjunto L. reuteri INIA P572, productor de reuterina, junto con glicerol (≤ 0,36%) en la elaboración de queso, sin perjudicar su calidad sensorial (Gómez-Torres et al., 2014, Garde et al., 2016a, Ávila et al., 2017).

Altas presiones hidrostáticas

La tecnología de altas presiones es probablemente el método de conservación de alimentos alternativo a los tradicionales tratamientos térmicos más desarrollado comercialmente. Permite la inactivación de microorganismos patógenos y alterantes, y prolongar la vida útil de los alimentos, con bajo impacto en la calidad nutritiva y sensorial del producto. El procesado con altas presiones implica someter al producto, una vez envasado en un material flexible y sumergido en un líquido transmisor (generalmente agua), a presiones entre 100 y 800 MPa (Figura 1.2).

El grupo del INIA ha desarrollado y patentado un nuevo método para prevenir la hinchazón tardía producida por las células vegetativas de C. tyrobutyricum. Se trata de la aplicación de un único ciclo de alta presión a baja temperatura y con un tiempo de aplicación corto, en quesos de siete días (Garde et al., 2016b). Este método puede aplicarse a todas las variedades de queso susceptibles de sufrir hinchazón tardía, preferentemente quesos semiduros y duros elaborados con leche cruda o pasteurizada de oveja, vaca, cabra, o sus mezclas. Por ejemplo, al presurizar quesos de leche cruda de oveja a 300 MPa, 10 minutos, conseguimos evitar la hinchazón tardía durante al menos dos meses, y los quesos presurizados obtuvieron unas puntuaciones similares a las del queso control para la intensidad y calidad del olor, del aroma y del sabor, calidad de la textura del color tras ser evaluados por un panel de catadores (Figura 2).

Bacteriófagos y sus endosilinas como agentes de biocontrol

Los bacteriófagos o fagos son virus que infectan exclusivamente a las bacterias y, en el caso de los fagos líticos, producen la lisis y muerte de la bacteria hospedadora, pudiendo considerarse agentes antimicrobianos (Endersen et al., 2014). La lisis bacteriana requiere la acción conjunta de dos enzimas del fago: la endolisina, que degrada el peptidoglicano de la pared celular de la bacteria, y la holina, que genera poros en su membrana citoplasmática. Las endolisinas también pueden provocar la lisis de bacterias gram positivas cuando se añaden exógenamente, ofreciendo a su vez un gran potencial como antimicrobianos. 

Actualmente estamos investigando el desarrollo de métodos basados en bacteriófagos y sus endolisinas para el biocontrol de Clostridium. Hemos conseguido aislar 96 fagos activos frente a C. tyrobutyricum de granjas-queserías, y estamos caracterizando su rango de hospedador, morfología, perfil de restricción del genoma y estabilidad a distintas temperaturas y pHs (Figura 1.3). Nuestros resultados apuntan a una buena supervivencia de algunos fagos durante ña fabricación y maduración del queso. En otro estudio en colaboración con investigadores del Quadram Institute of Bioscience (Reino Unido) hemos evaluado la actividad inhibitoria de la endolisina CTP1L (procedente del fago lítico φCTP1 de C. tyrobutyricum) frente a Clostridium, empleando una cepa de lactococos recombinante productora de CTP1L en la elaboración de queso. Con esta estrategia conseguimos retrasar la aparición de hinchazón tardía hasta los 60 días de maduración, y el queso mostró menores síntomas de hinchazón y concentración más baja de ácido butírico que el queso control de hinchazón, que presentó el defecto a los 30 días (Garde et al., 2020).

Extractos de plantas aromáticas

El interés por el uso de extractos de plantas aromáticas como conservantes alternativos en alimentos ha aumentado notablemente por sus propiedades bactericidas, fungicidas y antioxidantes (Figura 1.4). Durante las últimas décadas los aceites esenciales han sido objeto de una amplia investigación por su actividad antimicrobiana, y se ha visto que de los residuos de destilación producidos al obtener los aceites también pueden extraerse numerosos compuestos biológicamente activos y emplearse como antimicrobianos. El grupo de la Dra. Berruga, de la Universidad de Castilla La Mancha (UCLM) ha conseguido prevenir el crecimiento de Clostridium spp. en queso elaborado con aceite esencial de romero, mientras que el queso control presentó un recuento superior a tres unidades logarítmicas/gramo (Moro et al. 2015). Además, en un modelo de queso de oveja elaborado con leche fortificada con aceites esenciales, observaron que los de melisa, albahaca y tomillo muestran una fuerte actividad anti-clostridium (Licón et al., 2020). Actualmente, en colaboración con el grupo de la UCLM, estamos evaluando la actividad inhibitoria de aceites esenciales de distintas plantas aromáticas y de los extractos de residuos de destilación de estas plantas frente a cepas de Clostridium spp. aisladas de quesos Manchegos con hinchazón tardía, y también en la elaboración de quesos inoculados con esporas de C. tyrobutyricum.

Otras estrategias

Otra estrategia que ha sido investigada para prevenir la hinchazón tardía de queso es la irradiación, que reduce el número de microorganismos en los alimentos tratados al dañar su ADN, incluso irreversiblemente. La aplicación de una dosis de irradiación de 3 kGy al queso redujo un 96% las esporas de C. tyrobutyricum (Velasco et al., 2011). Aunque esta dosis perjudicó ligeramente el olor y el sabor del queso, éste se consideró aceptable para el consumo tras su evaluación sensorial. Otros autores han propuesto añadir leche de burra a la leche de vaca al elaborar queso para prevenir la hinchazón tardía, basándose en el alto contenido en lisozima de la leche de burra (1,0 – 3,7 mg/ml vs. 0,13 μg/ml) (Consentino et al., 2015). La adición de un 8% de leche de burra previno la hinchazón tardía en quesos contaminados con C. tyrobutyricum durante 120 días de maduración. Además, el empleo de leche de burra no afectó a la aceptabilidad del producto tras su evaluación sensorial.

Aunque actualmente resulta imposible evitar el riesgo de contaminación de la leche y el queso con esporas de Clostridium spp., esperamos que las investigaciones en marcha permitan que el sector disponga de métodos para controlar el crecimiento en el queso de estas bacterias y la hinchazón tardía que causan.

Referencias:

- Ávila, M., Gómez-Torres, N., Delgado, D., Gaya, P., Garde, S., 2017. Industrial-scale application of Lactobacillus reuteri coupled with glycerol as a biopreservation system for inhibiting Clostridium tyrobutyricum in semi-hard ewe milk cheese. Food Microbiology, 66, 104-109. 

- Ávila, M., Gómez-Torres, N., Gaya, P., Garde, S., 2020. Effect of a nisin-producing lactococcal starter on the late blowing defect of cheese caused by Clostridium tyrobutyricum. International Journal of Food Science and Technology, 55, 3343–3349.

- Bogovic-Matijasic, B., Rajsp, M.K., Perko, B., Rogelj, I., 2007. Inhibition of Clostridium tyrobutyricum in cheese by Lactobacillus gasseri. International Dairy Journal, 17, 157–166.

- Cosentino, C., Paolino, R., Valentini, V., Musto, M., Ricciardi, A., Adduci, F., D’adamo, C., Pecora, G., Freschi, D., 2015. Effect of jenny milk addition on the inhibition of late blowing in semi-hard cheese. Journal of Dairy Science, 98, 5133–5142.

- Endersen, L., O’Mahony, J., Hill, C., Ross, R.P., McAuliffe, O., Coffey, A., 2014. Phage therapy in the food industry. Annual Review of Food Science and Technology, 5, 327–349.

- Garde, S., Ávila, M., Gaya, P., Arias, R., Nuñez, M., 2011. Outgrowth inhibition of Clostridium beijerinckii spores by a bacteriocin-producing lactic culture in ovine milk cheese. International Journal of Food Microbiology, 150, 59-65.

- Garde, S., Ávila, M., Gómez-Torres, N., Gaya, P., Nuñez, M., 2016b. Método de prevención de la hinchazón tardía en queso mediante la aplicación de alta presión. N.º Publicación: ES 2537155 A2. 

- Garde, S., Ávila, M., Gómez, N., Nuñez, M., 2013. Clostridium in late blowing defect of cheese: detection, prevalence, effects and control strategies. En: Castelli H, du Vale L (Eds.) Cheese: Production, Chemistry and Sensory Properties. Nova Science Publishers, NY, 503-518.

- Garde, S., Calzada, J., Sanchez, C., Gaya, P., Narbad, A., Meijers, R., Mayer, M.J., Avila, M., 2020. Effect of Lactococcus lactis expressing phage endolysin on the late blowing defect of cheese caused by Clostridium tyrobutyricum. International Journal of Food Microbiology, 329, 108686. 

- Garde, S., Gómez-Torres, N., Delgado, D., Gaya, P., Ávila, M., 2016a. Influence of reuterin-producing Lactobacillus reuteri coupled with glycerol on biochemical, physical and sensory properties of semi-hard ewe milk cheese. Food Research International, 90, 177-185. 

- González, L., Zárate, V., 2015. Inhibitory activity of Lactobacillus plantarum TF711 against Clostridium sporogenes when used as adjunct culture in cheese manufacture. Journal of Dairy Research, 82, 236-241.

- Gómez-Torres, N., Ávila, M., Gaya, P., Garde, S., 2014. Prevention of late blowing defect by reuterin produced in cheese by a Lactobacillus reuteri adjunct. Food Microbiology, 42, 82-88.

- Licón, C.C., Moro, A., Librán, C.M., Molina, A.M., Zalacain, A., Berruga, M.I., Carmona, M., 2020. Volatile transference and antimicrobial activity of cheeses made with ewes’ milk fortified with essential oils. Foods, 9, E35.

- Martínez-Cuesta, M.C., Bengoechea, J., Bustos, I., Rodríguez, B., Requena, T., Peláez, C., 2010. Control of late blowing in cheese by adding lacticin 3147-producing Lactococcus lactis IFPL 3593 to the starter. International Dairy Journal, 20, 18-24.

- Moro, A., Librán, C.M., Berruga, M.I., Carmona, M., Zalacain, A., 2015. Dairy matrix effect on transference of rosemary (Rosmarinus officinalis) essential oil compounds during cheese making. Journal of the Science of Food and Agriculture, 95, 1507-1513.

- Rilla, N., Martínez, B., Delgado, T., Rodríguez, A., 2003. Inhibition of Clostridium tyrobutyricum in Vidiago cheese by Lactococcus lactis spp. lactis IPLA 729, a nisin Z producer. International Journal of Food Microbiology, 85, 23–33.

- Velasco, R., Ordóñez, J.A., Cabeza, M.C., de la Hoz, L., Cambero, M.I., 2011. Use of the E-beam radiation to diminish the late blowing of cheese. International Dairy Journal, 21, 493–500.